TA Cloning Diagram (Picture from wikimedia.org)
Produk PCR dapat diklon ke suatu vektor melalui “permainan gunting dan lem DNA” seperti yang pernah kami bahas sebelumnya. Ada beberapa pendekatan yang dapat dilakukan, yaitu melalui “blunt end” cloning, “TA” cloning dan “sticky end” cloning. Cara mana yang harus kita pilih? Yuk kita lihat apa untung rugi ketiga cara tersebut. +Continue Reading
Multichannel Pipet (Image from ic.daad.de)
Bekerja di laboratorium tentu tidak akan terlepas dari urusan ukur-mengukur. Untuk sampel padatan, kita akan berurusan dengan neraca analitik, sementara untuk sampel cairan, pipet volumetrik-lah andalannya. Akurasi dan presisi pemipetan merupakan faktor utama keberhasilan analisa atau percobaan yang melibatkan cairan. Pipet sudah digunakan sejak abad ke-19 oleh Louis Pasteur (1822-1895) dan kini jenis pipet sudah berkembang luas dengan tingkat akurasi dan presisi yang bermacam-macam pula. +Continue Reading
DNA atau Deoxyribonucleic Acid yang merupakan sandi genetik makhluk hidup ternyata dapat dijadikan bahan ‘permainan’ gunting dan tempel. Ya, ini serius lho. Para ahli rekayasa genetika kerapkali melakukan ‘permainan’ ini untuk memperoleh susunan DNA yang diinginkan dan memiliki fungsi tertentu. Istilah kerennya Rekayasa Genetika.
Contoh paling terkenal adalah yang terjadi pada gen insulin dari pankreas manusia yang dengan ‘permainan’ ini dapat dimasukkan ke dalam sel bakteri –seperti E. coli– atau tumbuhan –seperti safflower– dan diekspresikan di dalamnya sehingga saat ini kita dapat memperoleh insulin (obat diabetes) tanpa harus mengekstraknya langsung dari sapi atau babi, cukup dengan menumbuhkan bakteri atau tanaman hasil rekayasa genetika yang memiliki gen insulin dan memanen insulin darinya.
DNA ligase memperbaiki kerusakan kromosom. (Image from wikipedia.org)
Kita harus berterima kasih kepada para bakteri dan archaea karena umumnya mereka memiliki ‘gunting’ berupa enzim yang dapat memotong-motong DNA secara spesifik. Enzim ini berguna sebagai bentuk pertahanan bakteri terhadap DNA-DNA asing yang masuk ke dalam sel bakteri. DNA asing ini akan dipotong-potong agar tidak akan membahayakan bakteri lagi oleh enzim yang disebut ‘Restriction Endonuclease‘ (sering disebut enzim restriksi). DNA si bakteri sendiri sudah terlindungi dengan mekanisme tertentu (metilasi) sehingga akan terhindar dari pemotongan. Suatu sistem pertahanan yang sangat cerdas untuk makhluk sekelas bakteri.
Sedangkan ‘lem’ DNA secara alami terdapat baik pada eukaryota maupun prokaryota. Secara komersial, enzim ini diperoleh dari virus tertentu seperti bakteriofage T4 yang memiliki enzim ligase yang dapat menyambungkan gugus -OH pada suatu utas DNA dengan gugus -PO4 pada utas lainnya membentuk ikatan phosphodiester. Enzim ini pada dasarnya berfungsi untuk memperbaiki kerusakan-kerusakan pada kromosom.
Nah, para ilmuwan rekayasa genetika telah berhasil mengisolasi ratusan jenis ‘gunting’ untuk memotong-motong DNA dan ‘lem’ DNA untuk menyambungkan kembali hasil potongan tersebut sehingga diperoleh DNA dengan susunan tertentu.
DNA tersusun atas empat basa nukleotoda yaitu A (adenine), G (guanine), C (cytosine) dan T (thymine). –Lihat kembali artikel tentang DNA di sini. Enzim restriksi (dalam hal ini adalah Restriction Endonuclease Type II) alias ‘gunting’ DNA hanya akan memotong DNA pada tempat tertentu saja, yaitu jika ia menemukan susunan palindrom, urutan basa yang jika dibaca dari kedua utas DNA akan tetap sama. Perhatikan contoh sekuen berikut ini:
5'-GATATC-3' :::::: 3'-CTATAG-5'
Baik di utas atas maupun bawah memiliki sekuen yang sama bukan (dibaca dari 5′ ke 3′)? Nah, di sekuen palindrom seperti itulah enzim restriksi akan bekerja.
Setiap enzim restriksi hanya dapat memotong pada susunan palindrom tertentu. Misalnya enzim EcoRI akan bekerja jika menemukan urutan GAATTC, enzim SmaI pada urutan CCCGGG, enzim AluI pada urutan AGCT, dan seterusnya.
Cara pemotongan DNA pun tidak sembarangan, masing-masing enzim punya titik pemotongan tertentu yang khas. Misalnya BamHI yang mengenali situ GGATCC akan memotong pada posisi antara dua G membentuk fragmen yang ujungnya ada yang tidak berpasangan (cohesive atau sticky ends).
5'-G GATCC-3' : : 3'-CCTAG G-5'
Sedangkan enzim PovII yang mengenali situs CAGCTG akan memotong di tengah situs pemotongan membentuk fragment yang semua ujungnya berpasangan (blunt ends):
5'-GGA TCC-3' ::: ::: 3'-CCT AGG-5'
Ada sekitar 600 enzim restriksi yang tersedia secara komersial saat ini. Berikut ini beberapa contoh enzim restriksi beserta situs pemotongannya.
List of Restriction Enzyme (Image from ncbi.nlm.nih.gov)
Situs Pengenalan dan Pemotongan Enzim Restriksi (Image from ncbi.nlm.nih.gov)
Kalau diperhatikan, nama enzim restriksi ini keren-keren juga. Ternyata ada maksudnya lho, begini aturannya:
Misalnya EcoRI berasal dari Escherichia coli strain RY13 yang pertama kali diidentifikasi, HindIII dari Haemophilus influenzae, dan lain-lain.
Enzim DNA ligase bekerja dengan menyambungkan utas DNA yang memiliki ujung 5′-PO4 dengan ujung 3′-OH pada utas lain. Mekanismenya bisa bermacam-macam, misalnya:
Ligation of Sticky Ends DNA (Image from wikipedia.org)
Ligation of Blunt Ends DNA (Image from wikipedia.org with modification)
Isochizomer adalah enzim-enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan yang sama. Hasil pemotongannya bisa sama dan bisa juga berbeda. Misalnya HpaII (situs pengenalan: C↓CGG) dan MspI (situs pengenalan: C↓CGG) adalah isoschizomer, begitu pula AatI (AGG↓CCT) dan StuI (AGG↓CCT).
Neoschizomer adalah bagian dari isoschizomer, memiliki situs pengenalan yang sama tetapi memotong pada tempat yang berbeda sehingga hasil pemotongannya pun berbeda. Misalnya AatII (situs pengenalan: GACGT↓C) dan ZraI (situs pengenalan: GAC↓GTC).
Tabel yang berisi daftar isoschizomer dan neoschizomer dapat ditemukan di situs NEB (New England Biolabs).
Ada beberapa enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan berbeda tetapi hasil pemotongannya memiliki ujung overhang yang sama. Misalnya AccIII (T↓CCGGA) dengan AgeI (A↓CCGGT) yang menghasilkan ujung overhang CCGG.
Sifat ini sangat penting dalam aspek rekayasa genetika, terutama bila fragmen DNA yang akan kita klon memiliki situs pengenalan enzim restriksi yang berbeda dengan vektornya. Asalkan hasil pemotongan memiliki ujung overhang yang sama maka proses ligasi dapat dilakukan kemudian.
Nah, dengan menggunakan bantuan kedua jenis enzim ini, para ilmuwan rekayasa genetika bisa mengutak-atik DNA untuk keperluan tertentu seperti rekombinasi DNA yang menghasilkan DNA rekombinan. Secara garis besar berikut adalah proses yang terjadi:
Cloning gene of interest into plasmid (Image from bio.davidson.edu)
Masih banyak aplikasi lain dari enzim restriksi dan DNA ligase, kita akan coba bahas dalam artikel lain. Jangan lupa memberikan komentar untuk kami.
Stem Cell (image from gothamgazette.com)
A. Penelitian Stem Cell
Pada awal tahun 1980-an, para ilmuan belajar bagaimana membuat Embrionic stem cell dari tikus dan menumbuhkannya di laboratorium. Pada tahun 1998, mereka pertama kali mereproduksi Embrionic stem cell manusia di laboratorium.
Sebagaimana yang sudah dijelaskan pada artikel ‘Mengenal Stem Cell’, Embrionic stem cell merupakan Stem cell yang didapat dari embrio yang sudah dibuahi. Namun bagaimana caranya para peneliti mendapatkan embrio manusia..?? +Continue Reading
Stem cell dalam bahasa Indonesia disebut juga sel batang atau sel induk, sel ini dapat berkembang menjadi sel apa saja.
Stem cell pada dasarnya adalah blok pembangun (building block) pada tubuh manusia. Stem cell di dalam embrio pada akhirnya akan berkembang menjadi sel, organ dan jaringan di dalam tubuh janin. Tidak seperti sel biasa, yang hanya bisa mereplikasi untuk membuat sel sejenis, stem cell bersifat pluripotent. Ketika terbelah, stem cell bisa menjadi salah satu dari 220 sel yang berbeda dalam tubuh manusia. Stem cell juga memiliki kemampuan untuk memperbaharui diri sendiri – mereka dapat mereproduksi diri berkali-kali.
Stem cell mempunyai kemampuan yang luar biasa untuk berkembang menjadi banyak jenis sel berbeda di dalam tubuh selama masa awal pertumbuhan. Selain itu juga, di banyak jaringan mereka bertindak layaknya system perbaikan internal (Internal Repair System). Ketika Stem cell membelah, masing-masing sel baru memiliki potensi tetap sebagai Stem cell atau menjadi sel jenis lain dengan fungsi yang spesifik, seperti sel otot, sel darah merah, atau sel otak.
Sampai sekarang, para scientist bekerja dengan dua jenis stem cell, Embrionic Stem cell dan Somatic/Adult stem cell.
Embrionic stem cell adalah stem cell yang didapat dari embrio yang sudah dibuahi. Ketika embrio berumur antara tiga sampai lima hari, ia mengandung stem cell, yang sibuk bekerja untuk menciptakan berbagai organ dan jaringan yang akan membentuk janin.
Embrionic stem cell pertama kali diperoleh dari embrio tikus percobaan sekitar 30 tahun yang lalu, pada tahun 1981. Kemudian pada tahun 1998 para scientist berhasil mendapatkan Embrionic stem cell dari embrio manusia dan mengembangkannya di dalam laboratorium. Sel ini di sebut Human embrionic stem cell.
Gambar 1. Embrionic Stem Cell
Di dalam embrio terdapat puluhan Stem cell. Pada awalnya, sel-sel ini masih ‘kosongan’, yang berarti bahwa nasib mereka belum ditentukan. Tapi mereka memiliki potensi yang sangat besar. Stem cell bersifat pluripotent, yang berarti mereka dapat berkembang menjadi berbagai jenis sel, berbagai jenis jaringan dan berbagai organ dalam tubuh manusia.
Adult stem cell adalah stem cell yang diperoleh dari sel-sel orang dewasa. Orang dewasa juga memiliki Stem cell di jantung, otak, sumsum tulang, paru-paru dan organ lainnya. Mereka adalah alat perbaikan built-in kita, meregenerasi sel yang rusak oleh penyakit, cedera dan juga karena ‘pemakaian’ sehari-hari. Adult stem cell mempunyai potensi yang lebih terbatas dari Embrionic stem cell, ia hanya mampu berkembang menjadi jenis jaringan yang sama dengan sel asal.
Adult Stem Cell
Tapi penelitian terbaru menunjukkan bahwa stem cell dewasa mungkin memiliki potensi untuk menghasilkan jenis sel lainnya juga. Sebagai contoh, sel-sel hati dapat dipakai untuk memproduksi insulin, yang biasanya dibuat oleh pankreas. Kemampuan ini dikenal sebagai plastisitas atau trans-differentiation.
Potensinya yang hampir tak terbatas telah membawa Stem cell menjadi fokus penelitian dunia medis.
Bayangkan, mereka memiliki kemampuan untuk mengembalikan ingatan pasien Alzheimer, menggantikan kulit yang hilang akibat kecelakaan yang mengerikan atau menyembuhkan orang yang begantung pada kursi roda agar kembali dapat berjalan.
Tapi sebelum para ilmuwan dapat menggunakan stem cell untuk tujuan medis, mereka harus belajar terlebih dahulu bagaimana menggunakan kekuatan mereka. Mereka tidak bisa mengobati penyakit sampai mereka belajar bagaimana memanipulasi stem cell agar mereka berkembang menjadi jaringan atau organ tertentu. Sekarang ini telah teramat banyak penelitian yang dilakukan untuk mengerti dan memahamai bagaimana cara kerja Stem cell dan bagaimana mengeksplorasi potensinya untuk kepentingan umat manusia. Untuk tahu lebih banyak lagi, silahkan menuju artikel berikut ini.
