9 Tips untuk Real-Time PCR
Image from www.labnews.co.uk
Anda tentu mengenal Realtime PCR, ada hal-hal penting yang harus kita fahami dan lakukan untuk mendapatkan hasil yang dapat dipercaya dan konsisten. Apalagi kita tahu bahwa setiap reaksi realtime PCR memakan biaya yang tidak sedikit.
Dibanding teknik PCR konvensional (end-point PCR), realtime PCR memiliki berbagai keunggulan. Selain amplifikasi alias perbanyakan DNA fragmen yang dapat diamati seketika (secara realtime), dengan teknik ini kita pun dapat menentukan konsentrasi DNA yang terdapat pada sample. Maka tak heran jika teknik ini sering pula disebut Quantitative PCR (qPCR).
Bagaimana bisa amplifikasi diamati secara realtime? Kuncinya ada pada pewarna (dye) fluorescent (baik SYBR Green atau oligonucleotide terlabel fluorescent) yang dicampurkan ke dalam reaksi amplifikasi. Dye fluorescent ini (misal SYBR Green) bersifat dapat berpendar ketika ditembak oleh sinar laser (energi) jika terikat pada DNA utas ganda. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA hasil amplifikasi dapat diikuti secara realtime, semakin banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan. Sementara itu quantitative PCR dimungkinkan karena sensitifitas dye yang sangat tinggi, bahkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA hingga hitungan picogram (atau setara dengan sel tunggal saja!).
Sensitifitas yang tinggi seperti ini tentu saja rentan terhadap bias, sehingga perlu diperhatikan beberapa teknik berikut ini agar data yang diperoleh bisa konsisten dari waktu ke waktu dan selalu dapat diandalkan. Masalah yang sering muncul adalah adanya kontaminan dan ketidakkonsistenan hasil diantara ulangan.
Campur dengan Baik
Pembuatan mastermix adalah tahapan krusial dalam realtime PCR, sebab campuran pereaksi-pereaksi ini (dye, nukleotida, enzim, buffer, dll) selanjutnya akan dialiquot ke masing-masing tube/plate reaksi. Jika mastermixnya tidak homogen, maka jangan harap kita akan mendapatkan hasil yang konsisten.
Pastikan mastermix (baik yang fresh maupun yang telah disimpan di dalam freezer) telah tercampur dengan baik sebelum dialiquot, gunakanlah vortex.
Larutkan primer di dalam buffer
Seringkali kita melarutkan stok primer menggunakan air (ddH2O), padahal pH air bisa saja rendah (apalagi DEPC-treated ddH2O) yang bisa merusak DNA dalam waktu lama. Maka sebaiknya gunakan larutan buffer dengan pH netral untuk mencegah hidrolisis asam. Untuk mencegah aktifitas enzim DNase, bisa juga ditambahkan EDTA (1 mM) pada stok master primer, jangan takut EDTA akan menghambat aktifitas enzim Taq polymerase ketika PCR berlangsung karena konsentrasinya akan menjadi sangat kecil setelah dicampur menjadi mastermix/premix.
Biasakan untuk mengaliquot primer
Satu aturan yang harus ditaati dalam lab bioteknologi molekuler adalah sebisa mungkin hindarilah freeze/thawing, karena bisa mengundang kontaminan dan menyebabkan rusaknya primer. Maka jika kita mempunyai stok master primer (biasanya 100 uM), encerkanlah pada konsentrasi kerjanya (10 – 20 uM) menggunakan buffer netral dan buatlah aliquot. Usahakan agar primer tidak di-freeze-thaw lebih dari 5 kali.
Selain menghindari freeze-thaw berulang-ulang, peng-aliquot-an ini juga memudahkan kita saat terjadi kontaminasi, karena jika salah satu tabung primer terkontaminasi, kita masih memiliki stok primer lain yang masih bersih.
Gunakan pipet terkalibrasi dan ekslusif
Akurasi volume penambahan pereaksi seringkali menjadi masalah terutama jika volume yang ditambahkan sangat kecil. Untuk itu gunakan pipet sesuai jangkauan volumenya, gunakan teknik pemipetan yang baik dan pastikan pipet selalu dikalibrasi secara rutin.
Perlu disadari pula bahwa penggunaan pipet yang sama untuk berbagai keperluan merupakan sumber utama kontaminasi. Jangan gunakan pipet yang dipakai untuk ekstraksi DNA atau loading elektroforesis pada proses pembuatan mastermix realtime PCR, walaupun tips yang digunakan adalah tips aerosol resistant. Belilah satu set lengkap pipet yang didedikasikan khusus untuk pembuatan campuran pereaksi PCR, jangan dipakai untuk keperluan lain.
Buat kurva standar untuk setiap pasang primer baru
Setiap kali pesanan primer baru datang, buatlah sebuah kurva standar untuk menguji efisiensi reaksinya. Jangan mengasumsikan bahwa efisiensinya sama dengan primer yang sebelumnya digunakan, karena beda produksi bisa beda pula hasilnya.
Buatlah kurva standar 5 titik dengan jarak antar titik adalah 10 kali pengenceran. Pastikan bahwa kita dapat memperoleh efisiensi minimal 90% dengan menggunakan kontrol DNA.
Sediakan ruangan terpisah
Seperti halnya pipet, ruangan pun harus dibuat ekslusif dan terpisah, idealnya 3 ruangan, ruang ekstraksi DNA/RNA, ruang pembuatan campuran pereaksi (plus laminar air flow hood dengan sinar UV), serta ruang penambahan template DNA/RNA dan mesin realtime PCR itu sendiri. Dengan adanya pemisahan ruang dengan baik diharapkan tidak terjadi reaksi amplifikasi pada kontrol negatif akibat kontaminasi.
Cek ulang program siklus PCR
Cek ulang apakah kondisi siklus PCR sudah diprogram dengan benar sebelum reaksi PCR dimulai. Ini terutama wajib dilakukan jika mesin realtime PCR tersebut digunakan secara bersama-sama, karena ada kemungkinan program siklus PCR yang sudah kita simpan diubah oleh seseorang tanpa sepengetahuan kita. Tak ada salahnya kita mengecek ulang dari pada pada akhirnya reaksi amplifikasi kita gagal total.
Encerkan template
Realtime PCR jauh lebih sensitif dibanding PCR konvensional, jadi jangan samakan penambahan template untuk realtime PCR dengan PCR konvensional. Malahan seringkali jumlah template yang sedikit/encer memberikan hasil pengukuran yang lebih akurat. Di samping itu pengenceran dapat mengurangi efek kontaminan inhibitor yang mungkin terbawa saat isolasi DNA/RNA, karena ikut terencerkan maka efeknya terhadap akurasi sampel pun dapat ditekan.
Idealnya kurva sampel melintasi garis threshold antara siklus 20-30, ini dapat dicapai dengan mengatur konsentrasi sampel. Untuk sampel-sampel baru, kita bisa membuat dulu kurva kalibrasi (minimal 3 seri pengenceran standar) untuk melihat pada pengenceran sampel berapakah yang memberikan Ct (cycle threshold) yang berada di dalam kurva sehingga hasilnya akan akurat.
Buatlah larutan pengenceran fresh
Konsentrasi larutan asam nukleat (DNA/RNA) jika disimpan pada tabung plastik makin lama akan semakin berkurang. Ini karena asam nukleat dapat menempel pada dinding tabung. Oleh karena itu gunakan selalu serial pengenceran yang baru/fresh. Jika terpaksa harus menyimpannya untuk keperluan pengukuran berikutnya, maka gunakan Pelindung seperti carrier nucleid acid seperti tRNA, atau menggunakan tabung yang telah diberi perlakuan silikon atau dengan menggunakan tabung yang tidak mengikat DNA/RNA. Jangan lupa pula untuk mengukur kembali konsentrasinya sebelum digunakan untuk memastikan bahwa konsentrasinya tidak berubah.
Tips-tips di atas sangat penting diperhatikan terutama bagi para peneliti yang baru memulai penggunaan metode realtime PCR, karena langkah-langkah kecil seperti di atas sangat menentukan kekonsistenan dan tingkat kepercayaan hasil analisa kita.
Bagi Anda yang sudah terbiasa menggunakan realtime PCR, sangat kami tunggu urun-rembugnya jika ada hal-hal lain yang perlu diperhatikan selain yang telah kami uraikan. Bagian komentar di bawah ini dapat mewadahi kita untuk berdiskusi lebih lanjut.
Sumber: BiteSizeBio
Other articles you may like:
- Yang Wajib Anda Ketahui Tentang Pipet
- 6 Faktor Penting dalam Reverse Transcriptase PCR
- Menambahkan Ekor “A” pada Produk PCR Blunt
- Materi Presentasi Quantitative PCR
- Analisa Protein dengan Metode Bradford
- Cara Membuat Adapter Enzim Restriksi untuk Kloning PCR
- Desain Primer Menggunakan PerlPrimer
19 Comments
mas yepy, buffer pH netral untuk pengenceran primer itu contohnya apa saja? terimakasih sebelumnya
Yang paling umum digunakan adalah buffer 1X Tris-EDTA (TE) pH 7-8. Cara pembuatannya bisa dilihat di http://sciencebiotech.net/berbagai-larutan-buffer-2/
trims atas pengetahuan yang diberikan. hal ini banyak memberi pandangan bagi saya.kalau bisa tolong beri informasi tenteng bagaimana menentukan pemakaian primer dalam PCR dan info lengkap tentang gen bank. trims sebelumnya
Wah, mantap nih ada tips seperti ini. Bermanfaat bagi teman”lain.
Saya juga terbiasa menggunakan real time-PCR machine di lab, memang butuh preparation yang extra. Selain karena SYBR Green-nya yang mahal banget, juga karena mudah sekali terjadi kontaminasi (pada kontol negatif / water yang kita gunakan).
Biasanya untuk mencampur master mix dengan baik, saya tidak menggunakan vortex, tapi saya akan mencampur by pipetting gently up and down, 40-50 kali.
Ini disebutkan pada buku panduan protocol menggunakan SYBR Green.
Juga untuk Master mix, sebisa mungkin kita hindarkan dari cahaya, mungkin dengan membalut tabung master mix dengan aluminium voil, atau mengerjakan as soon as possible.
Yah, SYBR memang sangat sensitif dan juga barang mahal..
Selamat bereksperimen yaa..
mas, minta komparasi antara suspensi ekstrak DNA dng TE buffer n ddH2o dong… kelebihan dan kekurangan terutama dalam preservasi ekstrak DNA… thanks ya.. bisa gak kirim imel about this?.. atau sharing by imel?…
Mengenai ddH2O atau TE buffer utk melarutkan DNA, kurang lebih seperti ini perbandingannya:
keduanya dpt melarutkan DNA dgn baik
DNA akan lebih stabil kl dilarutkan dlm buffer TE krn pH-nya djaga sekitar 8. Kl dlm ddH2O, krn DNA memiliki sifat asam lemah (ingat: DNA=asam deoksiribonukleat), maka dlm waktu lama dpt menyebabkan DNA terdegradasi, apalagi DNase jg bekerja dlm pH yg sedikit asam. Jadi utk alasan kestabilan, buffer TE lbh unggul.
Meskipun buffer TE membuat stabil DNA, tp kl DNA itu bakal digunakan utk PCR, kita harus hati2. TE mengandung EDTA, yg dapat membentuk senyawaan kompleks dgn ion logam seperti Mg2+. Dlm hal ini EDTA merupakan “chelating agent”. Sedangkan Mg2+ adalah prekursor utk enzim Taq DNA polymerase yg digunakan utk PCR, jd kl kebanyakan EDTA, bisa2 reaksi PCR-nya terhambat. Jadi utk alasan ini, ddH2O lebih unggul.
So, pilih mana? Ya itu tadi, kl DNA-nya utk aplikasi PCR, lbh baik pake ddH2O, kl bukan, buffer TE bisa dipakai. Tapi kadang2 orang pake buffer Tris-HCl pH 8 sbg pengganti TE, krn gk mengandung EDTA.
Selain itu, faktor penyimpanan jg sngt berpengaruh:
Simpan pd suhu -20oC
Jgn sering-sering di-freeze-thaw
Oke mbak, semoga bs membantu.
mas,, mau tanya,, untuk mendeteksi DNA babi pada cangkang kapsul bisa ga pakai real time PCR.. ? makasih ya mas..
Halo Desi, sorry baru reply…
Pada intinya, jika pada bahan yang akan kita amati/teliti/periksa terdapat DNA yang menjadi perhatian kita (mis. babi), maka bisa dilakukan teknik PCR, baik PCR konvensional maupun realtime PCR. Yang perlu diperhatikan adalah apakah bahan pada cangkang kapsul itu mengandung bahan berupa sel-sel babi (salah satu bagian tubuhnya seperti bulu, otot, tulang, dll) atau hanya zat kimia tertentu yang berasal dari babi saja (misalnya lemak). Sebab jika kandungannya tidak mengandung sel tubuh babi, maka otomatis tidak ada DNA babi di situ dan PCR tidak dapat dilakukan.
Selanjutnya yang perlu dilakukan adalah merancang primer untuk PCR/realtime PCR, pilihlah gen atau bagian DNA tertentu yang khas untuk babi dan tidak terdapat pada hewan/makhluk hidup lainnya agar lebih mudah dalam identifikasinya.
Bagaimana? semoga dapat difahami…
mas…kalau kita mau pelatihan basic real-time, dimana yah yg mas bisa rekomendasikan? atau mas bisa melatih kita gak? biasa kami pakai untuk analisa bakteri patogen…makasih mas atas infonya…
Kalo pelatihan saya kurang tau info-nya. Tapi kalo mau mungkin saya dan temen-temen bisa membantu mengadakan pelatihan. Nanti bisa kontak saya lewat email aja biar lebih jelas lagi… thanks…
mas, mau bertanya, dalam pengoptimasian konsentrasi primer, bagaimana dan apa saja yg hrs diperhatikan untuk memutuskan bahwa konsentrasi primer x adalah yg paling optimum?
kemudian, untuk pengkuantifikasian real-time PCR, sebenarnya bagaimana prinsipnya? yang saya lakukan adalah dengan membuat kurva standar kultur murni Salmonella (pengujian salmonella pada susu), apakah sdh benar? kurva std yg skrg sdg di buat sangat sulit memperoleh efisiensi yg bagus, kenapa yh? bagaimana solusinya? mungkin ada buku2 referensi yg bisa saya baca..
terima kasih sebelumnya
Halo Dwi,
Secara umum biasanya konsentrasi akhir primer yang ditambahkan dalam larutan PCR adalah 0.5 – 1 pmol/µl. Jadi untuk reaksi PCR 20 µl, kita bisa menambahkan 0.5 – 1 µl primer dengan konsentrasi 20 µM (20 pmol/µl). Perlu diperhatikan untuk primer yang degenerate, jumlah primer harus ditambahkan berlebih sesuai jumlah degenerate base-nya.
Untuk optimasi konsentrasi primer, bisa dicoba dengan membuat beberapa reaksi PCR dengan range konsentrasi primer berbeda-beda, dan parameter lainnya dibuat tetap (konsentrasi pereaksi/enzim, suhu PCR, dll). Lalu dilihat hasil PCR mana yang menghasilkan pita paling baik (tunggal, tebal dan tidak terbentuk primer dimer).
Mengenai kuantifikasi Realtime PCR, betul sekali bahwa prinsipnya adalah dengan membuat kurva standard. Namun yang perlu diperhatikan apa yang kita jadikan template untuk reaksi standard tersebut. Yang paling baik adalah dengan membuat klon dari target PCR ke plasmid. Jadi buatlah dulu reaksi PCR dengan primer yang sama, kemudian produk PCR tersebut diklon ke plasmid menggunakan cloning vector (misal pGEM-T-easy, pTOPO, dll). Setelah diverifikasi hasil klonnya, plasmid rekombinan tersebut bisa dijadikan template untuk seri pengenceran standard.
Keuntungannya adalah:
plasmid bisa disimpan dan diperbanyak dengan mudah karena bisa dimasukkan ke E. coli competent cell, bisa disimpan di suhu -80oC sehingga setiap saat dibutuhkan mudah diperoleh.
karena plasmid ukurannya relatif kecil (sekitar 3 kb) dan berisi hanya target PCR, maka akurasi reaksi meningkat sehingga mudah untuk memperoleh kurva standard yang linear
mudah untuk menghitung konsentrasi, cukup diukur dengan spectrophotometer/nanodrop, lalu dihitung copy numbernya.
Buku referensi sangat banyak sekali, misalnya buku “Real-time PCR” M. Tevfik Dorak (Editor) terbitan Taylor & Francis Group (http://www.garlandscience.com)
Semoga bisa membantu
trima kasih banyak mas, sangat membantu. mungkin mengenai klon target ke dalam plasmid akan dipertimbangkan dan difikirkan lg bagaimana.
mas mau tanya, sya sdh mengerjakan real-time PCR untk uji kualitatif babi pada sampel. Namun terjadi kontaminasi bahkan RNAse free water saja dapat teramplifikasi dg bagus. Ketika di elektroforesis terdapat pita yg sama dg babiny. Hal yg sama jg tjd ktika menggantiny dg buffer TE dan milliQ steril.
Kira-kira permasalahan kontaminasi itu berasal dr mana? dan solusinya apa mas?
terima kasih banyak.
Dear mbak Aisyah,
Kontaminasi pada realtime PCR memang sering membuat frustasi, mengingat ia sangat sensitive sehingga pengotor yang sangat sedikit pun bisa menyebabkan terbentuknya produk yang tidak diinginkan.
Saran saya adalah:
- mengganti semua reagent dengan yg baru, mungkin bisa dicoba satu per satu agar diketahui Sumber kontaminasinya. Misalnya membuat reaksi tanpa template, lalu tanpa primer, dan seterusnya
- menata kembali ruang persiapan reagent PCR, ruang persiapan sample dan ruang mesin PCR, sangat dianjurkan terpisah, dilengkapi laminar air flow dan mengikuti alur dan Tata letak yang baik (bisa merujuk pada buku2 referensi)
- melakukan cara kerja yg baik dan bersih
- menggunakan pipet tips bersih, steril dan memiliki filter. Atau gunakan pipet positive displacement.
Mungkin yang lain Ada yang bisa menambahkan?
Aslkum mas yepi, Apa kabar?
Mas sy mau tanya, sy baru nyoba running realtime PCR.., sy masih terkendala untuk kurva standarnya, dr bbp kali running nilai efisiensinya jelek sekali. yang ingin sy tanyakan: 1) Berapa konsentrasi DNA plasmid/cDNA stok yang ideal digunakan?, 2) untuk pengukuran konsentrasi DNA dengan spektro, apakah yang diukur hanya pd stok atau setiap serial pengencerannya jg diukur, 3 untuk membuat serial pengeceran, menghomogenkan apa cukup diresuspensi atau di vortex, karna terkadang konsentrasinya tidak linier dengan serial pengencerannya.. sebelumnya terimakasih atas jawaban n infonya mas
Wa’alaikumussalam wr.wb. Halo Mas Khairul, alhamdulillah baik mas..
1. Konsentrasi DNA Plasmid/cDNA stok yang digunakan bisa berbeda-beda untuk setiap percobaan. Yang bisa dijadikan patokan adalah CT (cycle threshold) yang dihasilkan serial standard tsb harus melingkupi CT sample kita. Dan idealnya CT standard berkisar antara 10 – 30 cycle. Jadi mungkin bisa dicoba salah satu konsentrasi standard, kemudian di-run pada Realtime PCR, dan dilihat nilai CT-nya. Baru dari situ dibuat seri pengenceran agar diperoleh range CT seperti saya sebutkan tadi.
2. Jika pengenceran yang dilakukan ideal/sempurna, maka pengukuran stok saja sudah cukup, lalu dihitung berdasarkan faktor pengencerannya. Tapi biasanya terjadi pipetting error saat pengenceran, jadi konsentrasi aktual sebaiknya diukur lagi untuk masing-masing pengenceran.
3. Menurut saya vortex akan lebih meyakinkan dibanding resuspensi. Masalah ketidaklinearan serial pengenceran, faktor utama penyebabnya adalah pipetting error. Untuk itu sangat penting digunakan pipet yang akurat dan terkalibrasi secara berkala.
Begitu mas, semoga bisa membantu…
Kekurangan RT PCR daripada PCR konvensional apa?? Selain dari segi ekonomi
Halo Ika, hmm.. setau saya yang ada justru kelebihan RT PCR dibanding PCR konvensional
Kalaupun dibilang sebagai kekurangan saya kira itu sebagai konsekuensi dari lebih canggihnya RT PCR, misalnya dengan RT PCR biaya lebih tinggi karena memang ada reagent tambahan khusus yg diperlukan seperti pewarna, probe Taqman, dll. Selain itu juga diperlukan kecermatan dan ketelitian yang tinggi pada tahap persiapan mastermix/premix, karena error yang sedikit saja pada tahap tersebut bisa terlihat dalam hasil analisanya mengingat RT PCR lebih sensitif dibanding PCR konvensional.
Begitu Ika, semoga membantu ya..