Comments on: 9 Tips untuk Real-Time PCR

By: yepyhardi

yepyhardi — Sat, 19 Nov 2011 06:22:32 +0000

Halo Ika, hmm.. setau saya yang ada justru kelebihan RT PCR dibanding PCR konvensional Kalaupun dibilang sebagai kekurangan saya kira itu sebagai konsekuensi dari lebih canggihnya RT PCR, misalnya dengan RT PCR biaya lebih tinggi karena memang ada reagent tambahan khusus yg diperlukan seperti pewarna, probe Taqman, dll. Selain itu juga diperlukan kecermatan dan ketelitian yang tinggi pada tahap persiapan mastermix/premix, karena error yang sedikit saja pada tahap tersebut bisa terlihat dalam hasil analisanya mengingat RT PCR lebih sensitif dibanding PCR konvensional.
Begitu Ika, semoga membantu ya..

By: Ika

Ika — Fri, 18 Nov 2011 16:51:39 +0000

Kekurangan RT PCR daripada PCR konvensional apa?? Selain dari segi ekonomi

By: yepyhardi

yepyhardi — Wed, 24 Aug 2011 03:29:14 +0000

Wa’alaikumussalam wr.wb. Halo Mas Khairul, alhamdulillah baik mas..
1. Konsentrasi DNA Plasmid/cDNA stok yang digunakan bisa berbeda-beda untuk setiap percobaan. Yang bisa dijadikan patokan adalah CT (cycle threshold) yang dihasilkan serial standard tsb harus melingkupi CT sample kita. Dan idealnya CT standard berkisar antara 10 – 30 cycle. Jadi mungkin bisa dicoba salah satu konsentrasi standard, kemudian di-run pada Realtime PCR, dan dilihat nilai CT-nya. Baru dari situ dibuat seri pengenceran agar diperoleh range CT seperti saya sebutkan tadi.
2. Jika pengenceran yang dilakukan ideal/sempurna, maka pengukuran stok saja sudah cukup, lalu dihitung berdasarkan faktor pengencerannya. Tapi biasanya terjadi pipetting error saat pengenceran, jadi konsentrasi aktual sebaiknya diukur lagi untuk masing-masing pengenceran.
3. Menurut saya vortex akan lebih meyakinkan dibanding resuspensi. Masalah ketidaklinearan serial pengenceran, faktor utama penyebabnya adalah pipetting error. Untuk itu sangat penting digunakan pipet yang akurat dan terkalibrasi secara berkala.
Begitu mas, semoga bisa membantu…

By: irul

irul — Tue, 23 Aug 2011 06:35:48 +0000

Aslkum mas yepi, Apa kabar?
Mas sy mau tanya, sy baru nyoba running realtime PCR.., sy masih terkendala untuk kurva standarnya, dr bbp kali running nilai efisiensinya jelek sekali. yang ingin sy tanyakan: 1) Berapa konsentrasi DNA plasmid/cDNA stok yang ideal digunakan?, 2) untuk pengukuran konsentrasi DNA dengan spektro, apakah yang diukur hanya pd stok atau setiap serial pengencerannya jg diukur, 3 untuk membuat serial pengeceran, menghomogenkan apa cukup diresuspensi atau di vortex, karna terkadang konsentrasinya tidak linier dengan serial pengencerannya.. sebelumnya terimakasih atas jawaban n infonya mas

By: yepyhardi

yepyhardi — Thu, 07 Jul 2011 11:38:01 +0000

Dear mbak Aisyah,
Kontaminasi pada realtime PCR memang sering membuat frustasi, mengingat ia sangat sensitive sehingga pengotor yang sangat sedikit pun bisa menyebabkan terbentuknya produk yang tidak diinginkan.
Saran saya adalah:
- mengganti semua reagent dengan yg baru, mungkin bisa dicoba satu per satu agar diketahui Sumber kontaminasinya. Misalnya membuat reaksi tanpa template, lalu tanpa primer, dan seterusnya
- menata kembali ruang persiapan reagent PCR, ruang persiapan sample dan ruang mesin PCR, sangat dianjurkan terpisah, dilengkapi laminar air flow dan mengikuti alur dan Tata letak yang baik (bisa merujuk pada buku2 referensi)
- melakukan cara kerja yg baik dan bersih
- menggunakan pipet tips bersih, steril dan memiliki filter. Atau gunakan pipet positive displacement.

Mungkin yang lain Ada yang bisa menambahkan?

By: ais

ais — Tue, 14 Jun 2011 01:42:10 +0000

mas mau tanya, sya sdh mengerjakan real-time PCR untk uji kualitatif babi pada sampel. Namun terjadi kontaminasi bahkan RNAse free water saja dapat teramplifikasi dg bagus. Ketika di elektroforesis terdapat pita yg sama dg babiny. Hal yg sama jg tjd ktika menggantiny dg buffer TE dan milliQ steril.
Kira-kira permasalahan kontaminasi itu berasal dr mana? dan solusinya apa mas?
terima kasih banyak.

By: dwi

dwi — Sun, 12 Jun 2011 14:49:48 +0000

trima kasih banyak mas, sangat membantu. mungkin mengenai klon target ke dalam plasmid akan dipertimbangkan dan difikirkan lg bagaimana.

By: yepyhardi

yepyhardi — Sun, 12 Jun 2011 07:25:22 +0000

Halo Dwi,
Secara umum biasanya konsentrasi akhir primer yang ditambahkan dalam larutan PCR adalah 0.5 – 1 pmol/µl. Jadi untuk reaksi PCR 20 µl, kita bisa menambahkan 0.5 – 1 µl primer dengan konsentrasi 20 µM (20 pmol/µl). Perlu diperhatikan untuk primer yang degenerate, jumlah primer harus ditambahkan berlebih sesuai jumlah degenerate base-nya.
Untuk optimasi konsentrasi primer, bisa dicoba dengan membuat beberapa reaksi PCR dengan range konsentrasi primer berbeda-beda, dan parameter lainnya dibuat tetap (konsentrasi pereaksi/enzim, suhu PCR, dll). Lalu dilihat hasil PCR mana yang menghasilkan pita paling baik (tunggal, tebal dan tidak terbentuk primer dimer).
Mengenai kuantifikasi Realtime PCR, betul sekali bahwa prinsipnya adalah dengan membuat kurva standard. Namun yang perlu diperhatikan apa yang kita jadikan template untuk reaksi standard tersebut. Yang paling baik adalah dengan membuat klon dari target PCR ke plasmid. Jadi buatlah dulu reaksi PCR dengan primer yang sama, kemudian produk PCR tersebut diklon ke plasmid menggunakan cloning vector (misal pGEM-T-easy, pTOPO, dll). Setelah diverifikasi hasil klonnya, plasmid rekombinan tersebut bisa dijadikan template untuk seri pengenceran standard.
Keuntungannya adalah:

plasmid bisa disimpan dan diperbanyak dengan mudah karena bisa dimasukkan ke E. coli competent cell, bisa disimpan di suhu -80oC sehingga setiap saat dibutuhkan mudah diperoleh.
karena plasmid ukurannya relatif kecil (sekitar 3 kb) dan berisi hanya target PCR, maka akurasi reaksi meningkat sehingga mudah untuk memperoleh kurva standard yang linear
mudah untuk menghitung konsentrasi, cukup diukur dengan spectrophotometer/nanodrop, lalu dihitung copy numbernya.

Buku referensi sangat banyak sekali, misalnya buku “Real-time PCR” M. Tevfik Dorak (Editor) terbitan Taylor & Francis Group (http://www.garlandscience.com)

Semoga bisa membantu

By: dwi

dwi — Sat, 11 Jun 2011 10:02:46 +0000

mas, mau bertanya, dalam pengoptimasian konsentrasi primer, bagaimana dan apa saja yg hrs diperhatikan untuk memutuskan bahwa konsentrasi primer x adalah yg paling optimum?
kemudian, untuk pengkuantifikasian real-time PCR, sebenarnya bagaimana prinsipnya? yang saya lakukan adalah dengan membuat kurva standar kultur murni Salmonella (pengujian salmonella pada susu), apakah sdh benar? kurva std yg skrg sdg di buat sangat sulit memperoleh efisiensi yg bagus, kenapa yh? bagaimana solusinya? mungkin ada buku2 referensi yg bisa saya baca..
terima kasih sebelumnya

By: yepyhardi

yepyhardi — Thu, 05 May 2011 09:16:51 +0000

Kalo pelatihan saya kurang tau info-nya. Tapi kalo mau mungkin saya dan temen-temen bisa membantu mengadakan pelatihan. Nanti bisa kontak saya lewat email aja biar lebih jelas lagi… thanks…