Comments on: 9 Tips untuk Real-Time PCR

By: yepyhardi

yepyhardi — Wed, 09 May 2012 04:28:37 +0000

Wa’alaikumussalam wr.wb.
Mungkin mbak bisa lihat artikel saya berikut ini:
http://sciencebiotech.net/materi-presentasi-quantitative-pcr/
materinya bisa didownload di http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2009/05/090508%20-%20qPCR.pdf

By: yepyhardi

yepyhardi — Wed, 09 May 2012 04:02:38 +0000

Halo Rika, sorry baru reply,
SYBR Green umum digunakan sebagai pewarna pada Realtime PCR. Prinsip pewarnaan SYBR Green adalah dengan memancarkan cahaya fluorescent ketika SYBR Green tersebut menyisip pada double-strand DNA, mirip seperti Ethidium Bromida. Kelemahannya adalah dia dapat menyisip pada semua double-strand DNA alias produk Realtime PCR tanpa peduli apakah DNA tersebut adalah produk yang diinginkan ataukah pengotor/unspecific product. Jadi pewarnaan SYBR Green tidak selektif dan tidak spesifik.

By: myrna

myrna — Sat, 28 Apr 2012 21:05:18 +0000

assalamualaikum mas yepy..
sy mau tanya mengenai interpretasi hasil dr RT PCR ini,,,kalau ada wkt..tolong jelasin ttg kurva2 n CT nya ya,,,makasi bantuannya,,
wassalam..

By: rika

rika — Thu, 23 Feb 2012 23:15:18 +0000

Mas, mau tanya saya mau penelitian karena dana saya kurang maka saya memilih memakai SYBR Green Real TIme PCR (Quantifast SYBR Green). Apakah kekurangan dan kelebihan dari SYBR Green tersebut. tk

By: yepyhardi

yepyhardi — Sat, 19 Nov 2011 06:22:32 +0000

Halo Ika, hmm.. setau saya yang ada justru kelebihan RT PCR dibanding PCR konvensional Kalaupun dibilang sebagai kekurangan saya kira itu sebagai konsekuensi dari lebih canggihnya RT PCR, misalnya dengan RT PCR biaya lebih tinggi karena memang ada reagent tambahan khusus yg diperlukan seperti pewarna, probe Taqman, dll. Selain itu juga diperlukan kecermatan dan ketelitian yang tinggi pada tahap persiapan mastermix/premix, karena error yang sedikit saja pada tahap tersebut bisa terlihat dalam hasil analisanya mengingat RT PCR lebih sensitif dibanding PCR konvensional.
Begitu Ika, semoga membantu ya..

By: Ika

Ika — Fri, 18 Nov 2011 16:51:39 +0000

Kekurangan RT PCR daripada PCR konvensional apa?? Selain dari segi ekonomi

By: yepyhardi

yepyhardi — Wed, 24 Aug 2011 03:29:14 +0000

Wa’alaikumussalam wr.wb. Halo Mas Khairul, alhamdulillah baik mas..
1. Konsentrasi DNA Plasmid/cDNA stok yang digunakan bisa berbeda-beda untuk setiap percobaan. Yang bisa dijadikan patokan adalah CT (cycle threshold) yang dihasilkan serial standard tsb harus melingkupi CT sample kita. Dan idealnya CT standard berkisar antara 10 – 30 cycle. Jadi mungkin bisa dicoba salah satu konsentrasi standard, kemudian di-run pada Realtime PCR, dan dilihat nilai CT-nya. Baru dari situ dibuat seri pengenceran agar diperoleh range CT seperti saya sebutkan tadi.
2. Jika pengenceran yang dilakukan ideal/sempurna, maka pengukuran stok saja sudah cukup, lalu dihitung berdasarkan faktor pengencerannya. Tapi biasanya terjadi pipetting error saat pengenceran, jadi konsentrasi aktual sebaiknya diukur lagi untuk masing-masing pengenceran.
3. Menurut saya vortex akan lebih meyakinkan dibanding resuspensi. Masalah ketidaklinearan serial pengenceran, faktor utama penyebabnya adalah pipetting error. Untuk itu sangat penting digunakan pipet yang akurat dan terkalibrasi secara berkala.
Begitu mas, semoga bisa membantu…

By: irul

irul — Tue, 23 Aug 2011 06:35:48 +0000

Aslkum mas yepi, Apa kabar?
Mas sy mau tanya, sy baru nyoba running realtime PCR.., sy masih terkendala untuk kurva standarnya, dr bbp kali running nilai efisiensinya jelek sekali. yang ingin sy tanyakan: 1) Berapa konsentrasi DNA plasmid/cDNA stok yang ideal digunakan?, 2) untuk pengukuran konsentrasi DNA dengan spektro, apakah yang diukur hanya pd stok atau setiap serial pengencerannya jg diukur, 3 untuk membuat serial pengeceran, menghomogenkan apa cukup diresuspensi atau di vortex, karna terkadang konsentrasinya tidak linier dengan serial pengencerannya.. sebelumnya terimakasih atas jawaban n infonya mas

By: yepyhardi

yepyhardi — Thu, 07 Jul 2011 11:38:01 +0000

Dear mbak Aisyah,
Kontaminasi pada realtime PCR memang sering membuat frustasi, mengingat ia sangat sensitive sehingga pengotor yang sangat sedikit pun bisa menyebabkan terbentuknya produk yang tidak diinginkan.
Saran saya adalah:
- mengganti semua reagent dengan yg baru, mungkin bisa dicoba satu per satu agar diketahui Sumber kontaminasinya. Misalnya membuat reaksi tanpa template, lalu tanpa primer, dan seterusnya
- menata kembali ruang persiapan reagent PCR, ruang persiapan sample dan ruang mesin PCR, sangat dianjurkan terpisah, dilengkapi laminar air flow dan mengikuti alur dan Tata letak yang baik (bisa merujuk pada buku2 referensi)
- melakukan cara kerja yg baik dan bersih
- menggunakan pipet tips bersih, steril dan memiliki filter. Atau gunakan pipet positive displacement.

Mungkin yang lain Ada yang bisa menambahkan?

By: ais

ais — Tue, 14 Jun 2011 01:42:10 +0000

mas mau tanya, sya sdh mengerjakan real-time PCR untk uji kualitatif babi pada sampel. Namun terjadi kontaminasi bahkan RNAse free water saja dapat teramplifikasi dg bagus. Ketika di elektroforesis terdapat pita yg sama dg babiny. Hal yg sama jg tjd ktika menggantiny dg buffer TE dan milliQ steril.
Kira-kira permasalahan kontaminasi itu berasal dr mana? dan solusinya apa mas?
terima kasih banyak.