Bermain dengan ‘Gunting’ dan ‘Lem’ DNA
DNA atau Deoxyribonucleic Acid yang merupakan sandi genetik makhluk hidup ternyata dapat dijadikan bahan ‘permainan’ gunting dan tempel. Ya, ini serius lho. Para ahli rekayasa genetika kerapkali melakukan ‘permainan’ ini untuk memperoleh susunan DNA yang diinginkan dan memiliki fungsi tertentu. Istilah kerennya Rekayasa Genetika.
Contoh paling terkenal adalah yang terjadi pada gen insulin dari pankreas manusia yang dengan ‘permainan’ ini dapat dimasukkan ke dalam sel bakteri –seperti E. coli– atau tumbuhan –seperti safflower– dan diekspresikan di dalamnya sehingga saat ini kita dapat memperoleh insulin (obat diabetes) tanpa harus mengekstraknya langsung dari sapi atau babi, cukup dengan menumbuhkan bakteri atau tanaman hasil rekayasa genetika yang memiliki gen insulin dan memanen insulin darinya.
Bagaimana ‘permainan’ ini dilakukan?
DNA ligase memperbaiki kerusakan kromosom. (Image from wikipedia.org)
Kita harus berterima kasih kepada para bakteri dan archaea karena umumnya mereka memiliki ‘gunting’ berupa enzim yang dapat memotong-motong DNA secara spesifik. Enzim ini berguna sebagai bentuk pertahanan bakteri terhadap DNA-DNA asing yang masuk ke dalam sel bakteri. DNA asing ini akan dipotong-potong agar tidak akan membahayakan bakteri lagi oleh enzim yang disebut ‘Restriction Endonuclease‘ (sering disebut enzim restriksi). DNA si bakteri sendiri sudah terlindungi dengan mekanisme tertentu (metilasi) sehingga akan terhindar dari pemotongan. Suatu sistem pertahanan yang sangat cerdas untuk makhluk sekelas bakteri.
Sedangkan ‘lem’ DNA secara alami terdapat baik pada eukaryota maupun prokaryota. Secara komersial, enzim ini diperoleh dari virus tertentu seperti bakteriofage T4 yang memiliki enzim ligase yang dapat menyambungkan gugus -OH pada suatu utas DNA dengan gugus -PO4 pada utas lainnya membentuk ikatan phosphodiester. Enzim ini pada dasarnya berfungsi untuk memperbaiki kerusakan-kerusakan pada kromosom.
Nah, para ilmuwan rekayasa genetika telah berhasil mengisolasi ratusan jenis ‘gunting’ untuk memotong-motong DNA dan ‘lem’ DNA untuk menyambungkan kembali hasil potongan tersebut sehingga diperoleh DNA dengan susunan tertentu.
Restriction Endonuclease
DNA tersusun atas empat basa nukleotoda yaitu A (adenine), G (guanine), C (cytosine) dan T (thymine). –Lihat kembali artikel tentang DNA di sini. Enzim restriksi (dalam hal ini adalah Restriction Endonuclease Type II) alias ‘gunting’ DNA hanya akan memotong DNA pada tempat tertentu saja, yaitu jika ia menemukan susunan palindrom, urutan basa yang jika dibaca dari kedua utas DNA akan tetap sama. Perhatikan contoh sekuen berikut ini:
5'-GATATC-3' :::::: 3'-CTATAG-5'
Baik di utas atas maupun bawah memiliki sekuen yang sama bukan (dibaca dari 5′ ke 3′)? Nah, di sekuen palindrom seperti itulah enzim restriksi akan bekerja.
Setiap enzim restriksi hanya dapat memotong pada susunan palindrom tertentu. Misalnya enzim EcoRI akan bekerja jika menemukan urutan GAATTC, enzim SmaI pada urutan CCCGGG, enzim AluI pada urutan AGCT, dan seterusnya.
Cara pemotongan DNA pun tidak sembarangan, masing-masing enzim punya titik pemotongan tertentu yang khas. Misalnya BamHI yang mengenali situ GGATCC akan memotong pada posisi antara dua G membentuk fragmen yang ujungnya ada yang tidak berpasangan (cohesive atau sticky ends).
5'-G GATCC-3' : : 3'-CCTAG G-5'
Sedangkan enzim PovII yang mengenali situs CAGCTG akan memotong di tengah situs pemotongan membentuk fragment yang semua ujungnya berpasangan (blunt ends):
5'-GGA TCC-3' ::: ::: 3'-CCT AGG-5'
Ada sekitar 600 enzim restriksi yang tersedia secara komersial saat ini. Berikut ini beberapa contoh enzim restriksi beserta situs pemotongannya.
List of Restriction Enzyme (Image from ncbi.nlm.nih.gov)
Situs Pengenalan dan Pemotongan Enzim Restriksi (Image from ncbi.nlm.nih.gov)
Penamaan Enzim Restriksi
Kalau diperhatikan, nama enzim restriksi ini keren-keren juga. Ternyata ada maksudnya lho, begini aturannya:
- Huruf pertama adalah singkatan nama genus bakteri pemilik enzim tersebut
- Huruf kedua dan ketiga adalah singkatan nama spesies bakteri.
- Huruf keempat adalah dingkatan nama Strain.
- Huruf kelima adalah urutan penemuan enzim tersebut.
Misalnya EcoRI berasal dari Escherichia coli strain RY13 yang pertama kali diidentifikasi, HindIII dari Haemophilus influenzae, dan lain-lain.
Bagaimana ‘Lem’ DNA Bekerja?
Enzim DNA ligase bekerja dengan menyambungkan utas DNA yang memiliki ujung 5′-PO4 dengan ujung 3′-OH pada utas lain. Mekanismenya bisa bermacam-macam, misalnya:
Ligation of Sticky Ends DNA (Image from wikipedia.org)
- Menyambungkan utas-utas DNA yang sama-sama memiliki ujung overhang hasil pemotongan enzim restriksi. Ujung overhang ini harus saling komplemen agar dapat menempel dengan baik. Ujung overhang pada utas sense akan berpasangan dengan ujung overhang utas antisense. Lalu DNA Ligase tinggal membentuk ikatan phosphodiester sehingga kedua utas kini sudah menjadi satu dengan ikatan yang sangat kuat. Mekanisme ini cenderung lebih mudah karena kedua ujung overhang dapat menempel lebih dulu karena memiliki sekuen yang saling komplemen.
Ligation of Blunt Ends DNA (Image from wikipedia.org with modification)
- Menyambungkan utas-utas DNA yang sama-sama memiliki ujung blunt hasil pemotongan enzim restriksi atau hasil blunt PCR. DNA dengan ujung blunt lebih sulit untuk ‘dilem’ dengan enzim DNA Ligase karena tidak ada ujung overhang yang membantu kedua utas untuk saling menempel terlebih dulu sebelum ‘dilem’
Beberapa Sifat Khusus Enzim Restriksi
Isochizomer
Isochizomer adalah enzim-enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan yang sama. Hasil pemotongannya bisa sama dan bisa juga berbeda. Misalnya HpaII (situs pengenalan: C↓CGG) dan MspI (situs pengenalan: C↓CGG) adalah isoschizomer, begitu pula AatI (AGG↓CCT) dan StuI (AGG↓CCT).
Neoschizomer
Neoschizomer adalah bagian dari isoschizomer, memiliki situs pengenalan yang sama tetapi memotong pada tempat yang berbeda sehingga hasil pemotongannya pun berbeda. Misalnya AatII (situs pengenalan: GACGT↓C) dan ZraI (situs pengenalan: GAC↓GTC).
Tabel yang berisi daftar isoschizomer dan neoschizomer dapat ditemukan di situs NEB (New England Biolabs).
Kompatibilitas Ujung Overhang
Ada beberapa enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan berbeda tetapi hasil pemotongannya memiliki ujung overhang yang sama. Misalnya AccIII (T↓CCGGA) dengan AgeI (A↓CCGGT) yang menghasilkan ujung overhang CCGG.
Sifat ini sangat penting dalam aspek rekayasa genetika, terutama bila fragmen DNA yang akan kita klon memiliki situs pengenalan enzim restriksi yang berbeda dengan vektornya. Asalkan hasil pemotongan memiliki ujung overhang yang sama maka proses ligasi dapat dilakukan kemudian.
Aplikasi ‘Gunting’ dan ‘Lem’
Nah, dengan menggunakan bantuan kedua jenis enzim ini, para ilmuwan rekayasa genetika bisa mengutak-atik DNA untuk keperluan tertentu seperti rekombinasi DNA yang menghasilkan DNA rekombinan. Secara garis besar berikut adalah proses yang terjadi:
Cloning gene of interest into plasmid (Image from bio.davidson.edu)
Masih banyak aplikasi lain dari enzim restriksi dan DNA ligase, kita akan coba bahas dalam artikel lain. Jangan lupa memberikan komentar untuk kami.
Other articles you may like:
- Cara Membuat Adapter Enzim Restriksi untuk Kloning PCR
- Menambahkan Ekor “A” pada Produk PCR Blunt
- Memetakan Situs Enzim Restriksi
- Sintesis Gen vs Cloning
- Sistem Imun Bakteri; Belajar dari Serangan Musuh
- Membuat Pohon Filogenetik
- Tanya Jawab Seputar Analisa DNA Sequencing
2 Comments