Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular
Gel Electrophoresis; image from http://clearlyexplained.com/culture/health/electrophoresisgel.jpg
Saat ini, teknik pemisahan dan pemurnian DNA/RNA merupakan teknik yang tidak dapat dipisahkan dari biologi molekular. Hampir semua penelitian DNA/RNA mesti melibatkan pemisahan dan pemurnian yang tekniknya cukup beragam. Elektroforesis adalah salah satu teknik pemisahan paling populer, maka tak heran jika elektroforesis disebut sebagai pintu gerbang dari berbagai penelitian biologi molekular. Nah, sekarang ada baiknya kita telusuri dulu teknik-teknik tersebut dari masa ke masa.
Oh ya, pada prinsipnya elektroforesis itu adalah teknik pemisahan campuran molekul yang didasarkan pada perbedaan muatan listriknya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fasa diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda.
Elektroforesis dengan Kertas Saring
Smithies menerima hadiah Nobel
Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Bagaimana keduanya bisa mengungkap rahasia ini?
Paper Electrophoresis. Image from www.funsci.com
Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu mereka namakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.
Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, mereka dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.
Elektroforesis Gel Kanji
Starch Gel Electrophoresis. Image from http://www.terrapub.co.jp
Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu.
Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida. Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.
Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE)
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Image from www.siumed.edu
Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar.
Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.
Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Skema Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor membeberkan ide cerdasnya untuk memisahkan campuran DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada patogen.
Keempat teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian lainnya dalam bidang biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit dibayangkan sebuah laboratorium biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA yang sedang kita teliti akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan, sulit pula membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis selain dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun sangat bergantung pada teknik elektroforesis ini. Terima kasih kepada Markham dan Smith yang telah mencoba meneteskan RNA hidrolisat pada selembar kertas saring dan memisahkannya dengan arus listrik.
Sumber:
- Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group.
- http://dukeresearch.blogspot.com/2009/04/flipping-through-chronicles-of-nobel.html
Other articles you may like:
- Kenapa Minyak Masih Belum Tergantikan..?
- Mengenal Teknik DNA Sequencing
- Antibiotik yang Digunakan dalam Biologi Molekular
- JoVE: Katakan dengan Video
- Faktor Penentu Keberhasilan Analisa DNA sequencing
- 9 Tips untuk Real-Time PCR
- Aneuploidy, Beberapa Penyakit Akibat Variasi Genetik
...
terima kasih jawabannya….
untuk sampel negatif yg jenis pertama, terbentuknya pita dimungkinkan krn adanya ikatan dimer antar primer.
pada penelitian saya, hasil PCR dari sampel positif terbentuk pita pada daerah 190bp tapi yang sampel negatif terbentuk pita didaerah yang lebih besar sekitar 300an bp. yang mw saya tanyakan, knp ukuran sampel negatif lebih besar dari yg positif jika mungkin yg terbentuk itu ikatan dimer antar primer?atau ada alasan lain mengapa hasil PCR sampel negatif berukuran lebih besar drpd sampel positif? terima kasih…
dear mas yepy..
untuk NTC pcr yang kontaminasi itu seperti apa ya?
apakah setebal band yang kita inginkan?
masalahnya NTC saya selalu saja ada, tapi tipis banget..
apa berpengaruh banget y untuk proses selanjutnya?
o iya, saya mau tanya, jika di NTC ada bang yang sama, kira-kira datangnya dari mana y?
Halo Wika…
Secara teori, NTC alias Non-Template Control tidak akan menghasilkan band karena kita tidak memasukkan DNA apapun ke dalamnya kecuali primer yang mungkin bisa membentuk primer-dimer. Tapi biasanya primer-dimer ini ukurannya kecil saja tidak sampai 100 bp.
Kalau NTC kita menghasilkan band yang sama ukurannya dengan PCR produk yang kita inginkan, maka berarti ada kontaminasi DNA pada salah satu reagent yang digunakan, bisa pada ddH2O, larutan buffer, primer, enzim, atau dNTP. Dengan demikian produk PCR dari sampel menjadi bias, apakah berasal dari DNA target kita atau berasal dari kontaminasi. Biasanya kalau sudah begini hasil PCR tidak dapat diterima dan harus diulang hingga NTC-nya tidak menunjukkan band pada ukuran yang sama dengan target.
Kontaminasi bisa datang dengan berbagai cara, apakah melalui udara, bisa juga ketika melakukan pemipetan dengan cara yang tidak baik, dll.
terima kasih mas,
berarti, apa saja yang harus saya lakukan untuk mencegah, dan mengurangi terjadinya kontaminasi pada NTC..
apa mungkin kontaminsai datangnya dari mikroorganisme?
maaf mas, cara pemipetan yang benar memang gimana ya?
terima kasih banyak atas infonya..
wika
NTC bisa saja datang dari mikroorganisme, terutama jika kita melakukan PCR untuk gen-gen pada bakteri, jadi kita mesti bekerja dengan tempat dan alat-alat (laminar air flow, pipet, tabung, dll) yang bersih dan didedikasikan khusus untuk PCR, tidak dipakai untuk keperluan lain selain PCR.
Mengenai pemipetan yang benar, intinya jangan sampai kita mengkontaminasi apapun dengan benda yang seharusnya tidak ada di situ, dan jangan sampai reagent stock kita tercampur satu sama lain, misalnya taq polimerase yang terkontaminasi primer, dll. Hmm… mungkin kita perlu bahas dalam satu artikel khusus nih kayaknya..
pak, mohon pengarahannya…
saya mendapatkan tugas tetang apa itu elektroforesis , bagaimana cara penggunaannya, apa saja yg diperlukan dan macam2 elektroforesis…
untuk tugas tanggal 3 Mei 2010…
Halo Yudha, thanks atas pertanyaannya…
Teori-teori mengenai elektroforesis bisa diperoleh dari berbagai sumber baik dari buku-buku maupun situs-situs internet. Pada intinya elektroforesis adalah proses untuk memisahkan campuran senyawa berdasarkan perbedaan mobilitasnya di dalam medan listrik. Biasanya senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan pada sebuah media (fasa diam) seperti kertas atau gel yang dibasahi/direndam dalam suatu larutan buffer yang diberi muatan listrik.
Senyawa yang dapat dipisahkan melalui elektroforesis adalah senyawa yang bermuatan listrik, jika senyawa tersebut bermuatan listrik negatif (misal DNA/RNA) maka ia akan bergerak dari kutub/sisi yang diberi muatan listrik negatif ke kutub/sisi positif, begitu pula sebaliknya jika senyawa tersebut bermuatan listrik positif.
Kecepatan pergerakan senyawa di dalam medan listrik tersebut bergantung dari besarnya rasio muatan listrik senyawa tersebut terhadap massanya, dalam contoh DNA/RNA, maka DNA/RNA yang berukuran lebih kecil akan bergerak lebih cepat dibanding DNA/RNA yang ukurannya lebih besar, sehingga pada akhir proses elektroforesis, campuran DNA/RNA dengan berbagai ukuran tadi akan terpisah-pisah.
Alat dan bahan yang diperlukan untuk elektroforesis adalah (saya ambil contoh elektroforesis gel untuk memisahkan DNA/RNA):
Power supply
Tangki elektroforesis
Gel (biasanya gel agarose atau akrilamida)
Larutan Buffer (misalnya Tris-Acetil-EDTA atau TAE buffer, Tris-Boric Acid-EDTA atau TBE buffer)
Selain itu diperlukan pula larutan pewarna atau staining solution seperti Ethidium bromida untuk memvisualisasikan pita DNA/RNA hasil pemisahan.
Demikian mas Yhuda, semoga bisa membantu.
hallo mas yepy…
artikel2 yg ada di sciencebiotech ini benar2 membantu…..
ada yg mw saya tanyakan…
apa dalam proses elektroforesis itu deteksi pita2 DNAnya hanya bisa dengan EtBr?atau ada zat lain yang dapat digunakan?
jika melihat dalam tabel periodik,,Br terletak 1 golongan dg F, Cl, dan I…apakah ion2 itu bisa menggantikan Br dlm berikatan dg Etidium (misalnya EtF, EtCl, atau EtI)?
terimakasih…
jawabannya sangat ditunggu…..:)
Halo Fitri,
Sebetulnya banyak alternatif bahan kimia yang dapat digunakan untuk memvisualisasikan pita2 DNA hasil elektroforesis. Misalnya dye-dye berbasis SYBR atau cyanine yang banyak dijual secara komersial. Dasar pemilihan bahan untuk staining ini adalah tingkat kemampuannya berikatan dengan DNA/RNA, kemudahan penggunaannya, harga dan yang tak kalah penting adalah tingkat bahayanya. Seperti kita tahu EtBr bersifat mutagen, sehingga kini banyak ditawarkan alternatif lain yang lebih tidak berbahaya (bukan berarti tidak berbahaya sama sekali lho, jadi perlu penanganan yang sesuai prosedur).
Wah..hafal banget nih tabel periodiknya? Hmm…saya belum pernah denger sih kalau varian ethidium lain selain Br digunakan sebagai bahan dalam pewarnaan (staining) DNA/RNA, paling yang ada Propidium Iodide. Mungkin ini berkaitan dengan ukuran molekul Br- yang pas dengan struktur 3D-nya si Ethidium.
terima kasih jawabannya….
hehe…iya,,mslh tbl periodik sempet ada yg nanya juga jd bngung jwbnya…:)
EtBr,,diliat dr bahayanya….zat ini sangat berbahaya sekali,sangat mutagenik..tp knp msh bnyak dipakai ya?apa kelebihan2 dr EtBr dibanding zat yg lain spt dye-dye itu?
Sepertinya banyak faktor sih.. orang sudah lama menggunakan EtBr, jadi mungkin sebagian orang sulit pindah ke lain hati..eh..staining solution.
Selain itu mudah digunakan, dan termasuk cukup efektif menyisip dan berikatan dengan double strand DNA sehingga visualisasinya tergolong baik. Dan alasan lainnya yaitu…relatif murah
terima kasih bgt jawabannya….
mmg sciencebiotech top bgt deh..jd susah pindah ke lain hati…eh..web lain….haha……
halo mas yepi kami fitri dan restu..mau tanya lagi hihi
sebenernya etbr itu berikatan dgn DNA atau hanya menyisip saja sih? soalnya banyak artikel yg bilang cm nyisip aja, tapi kemrin kita nemu artikel yg menyebutkan bahwa etbr berikatan van der walls dengan DNA, krn etbr bersifat hidrofobik sama seperti basa pada DNA,itu jg alasan kenapa etbrnya berinterkalasi di bag dlam DNA (basanya) bukan diluar. jadi yg bener tuh yg mana yah hehe…ditanyain nih sma Dosen pembimbing hihi.
terima kasih sebelumnya =}
Yup… ikatan yang terjadi adalah interkalasi, jadi si EtBr yang memiliki cincin phenantridine yang hidrofobik bisa menyisip ke antara double strand DNA, yang mengakibatkan terjadi perubahan bentuk 3 dimensi dari cincin EtBr dan juga struktur perputaran pada backbone DNA. Karena EtBr berada dalam lingkungan hidrofobik, maka ion Br- nya akan mengusir molekul-molekul air yang berasosiasi dengan EtBr tadi yang menyebabkan EtBr dapat berpendar ketika disinari dengan UV.
Jadi ikatannya berupa ikatan Van Der Waals, bukan ikatan kovalen, karena cukup dengan perendaman yang lebih lama EtBr bisa lepas kembali ke larutan.
makasih yah mas yepy atas jwaban2 dan petunjuknya hihihi….makasssssssiihh buanyak.
by: restu nidia&fitri
Penelitian biologi molekular masa depan membutuhkan metode yang canggih, praktis, dan efisien. Dengan semakin meningkatnya kebutuhan akan analisis suatu biomaterial terhadap perkembangan ilmu hayati, pemahaman akan cara kerja alat dan analisis biomaterial dari suatu alat yang mendukung penelitian molekul hayati mengharuskan peneliti untuk menguasai teknik dan cara kerja elektroforesis….. ^_^..v