Gel Electrophoresis; image from http://clearlyexplained.com/culture/health/electrophoresisgel.jpg
Saat ini, teknik pemisahan dan pemurnian DNA/RNA merupakan teknik yang tidak dapat dipisahkan dari biologi molekular. Hampir semua penelitian DNA/RNA mesti melibatkan pemisahan dan pemurnian yang tekniknya cukup beragam. Elektroforesis adalah salah satu teknik pemisahan paling populer, maka tak heran jika elektroforesis disebut sebagai pintu gerbang dari berbagai penelitian biologi molekular. Nah, sekarang ada baiknya kita telusuri dulu teknik-teknik tersebut dari masa ke masa.
Oh ya, pada prinsipnya elektroforesis itu adalah teknik pemisahan campuran molekul yang didasarkan pada perbedaan muatan listriknya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fasa diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda.
Elektroforesis dengan Kertas Saring
Smithies menerima hadiah Nobel
Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Bagaimana keduanya bisa mengungkap rahasia ini?
Paper Electrophoresis. Image from www.funsci.com
Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ’siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu mereka namakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.
Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, mereka dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.
Elektroforesis Gel Kanji
Starch Gel Electrophoresis. Image from http://www.terrapub.co.jp
Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu.
Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida. Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.
Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE)
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Image from www.siumed.edu
Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar.
Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.
Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Skema Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor membeberkan ide cerdasnya untuk memisahkan campuran DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada patogen.
Keempat teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian lainnya dalam bidang biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit dibayangkan sebuah laboratorium biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA yang sedang kita teliti akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan, sulit pula membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis selain dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun sangat bergantung pada teknik elektroforesis ini. Terima kasih kepada Markham dan Smith yang telah mencoba meneteskan RNA hidrolisat pada selembar kertas saring dan memisahkannya dengan arus listrik.
Sumber:
- Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group.
- http://dukeresearch.blogspot.com/2009/04/flipping-through-chronicles-of-nobel.html
Similar Posts:
- Kenapa Minyak Masih Belum Tergantikan..?
- Mengenal Teknik DNA Sequencing
- Antibiotik yang Digunakan dalam Biologi Molekular
- JoVE: Katakan dengan Video
- Faktor Penentu Keberhasilan Analisa DNA sequencing
17 Comments
Elektroforesis dgn agarosa seringkali menimbulkan kesulitan dlm penanganan limbah ethidium bromidanya, mungkin ada yg bisa memberi saran? Selama ini limbah tsb sy kumpulkan dan blm diproses lagi.
Limbah Ethidium bromide (EtBr) bisa terdapat dalam 3 bentuk: gel, larutan/cairan dan benda2 lain yang terkontaminasi (sarung tangan, alat gelas). Penanganan ketiganya berbeda.
Gel elektroforesis. EtBr pada gel dalam jumlah sangat sedikit tidak membahayakan, bisa dibuang langsung ke tempat sampah lab. Tapi jika kandungannya cukup besar (>= 0.1% EtBr), apalagi jika berwarna pink atau kemerahan maka harus dimasukkan ke kotak biohazard untuk diincenerasi.
Larutan EtBr. Larutan air yang mengandung <10 ug/ml bisa langsung dibuang ke wastafel/saluran pembuangan air. Sedangkan jika >10 ug/ml, maka harus disaring atau diaktifasi menggunakan penyaringan charcoal/arang atau netralisasi menggunakan bahan kimia.
Benda terkontaminasi. Sarung tangan, tabung reaksi, tissue, dll yang terkontaminasi EtBr harus ditempatkan di dalam tempat sampah medis untuk diincenerasi. Jika kontaminasi cukup banyak, bisa dideaktifasi dulu menggunakan bleaching.
Mungkin nanti kita bahas dalam satu posting khusus mbak, karena masalah ini saya pikir sangat penting diterapkan di lab.
Sumber: EHS Princeton University
ok ditunggu postingannya. Kalo begitu apakah setiap lab hrs punya incenerator sendiri ya? Di Biotrop saluran dr wastafel di lab langsung ke pengolahan limbah, dan diproses secara biologis saja.
Saya pikir tidak harus setiap lab punya incenerator, bisa saja suatu institusi yang memiliki beberapa lab seperti di universitas memiliki satu incenerator yang digunakan bersama. Kalaupun tidak ada juga, limbah-limbah EtBr dengan konsentrasi tinggi (seperti dijelaskan di atas) dapat dikumpulkan dulu, kemudian dibawa ke tempat pengolahan limbah untuk dimusnahkan pada incenerator. Tentunya ini dilakukan sebagai tanggung jawab kita semua dalam memelihara lingkungan sekitar.
alhmdulillah bisa buat referensi TA Analisis DNA Manggis bengkalis, Riau
Terima kasih sudah berkunjung, kita seneng banget kalo artikel-artikel di SB bisa bermanfaat.
trim’s atas infonya.sy byk mendapat info. apakah bisa mengirimkan contoh dan pembacaan datanya,soalnya sy pemula dlm belajar ini krn tuntutan tnggungjwb dlm kerja.trims
halo pak Yepyhardi, saya masih pemula dalam hal teknik biosc. saya hendak lakukan penelitian genotyping dengan menggunakan teknik PFGE. Saya perlu list bahan – bahan yang diperlukan untuk running 30 isolat bakteri. apa bisa dibantu? dan dimana saya bisa memesannya ? terimakasih banyak
Halo Enty,
Untuk list bahan-bahan PFGE bisa kita temukan di berbagai sumber, baik buku-buku teknik laboratorium maupun secara online. Pada intinya bahan yang diperlukan hampir sama dengan elektroforesis biasa, yang membedakan terutama adalah perangkat elektroforesis dan power supply yang agak berbeda dibanding elektroforesis biasa. Sedangkan bahan-bahan kimia yang diperlukan juga standar-standar aja, mungkin yang berbeda adalah jenis agarose yang digunakan yaitu low melting agarose, yang lainnya seperti buffer (TAE/TBE), ethidium bromide, EDTA, ddH2O, dll.
Salah satu web yang memuat protokol PFGE yaitu http://www.eupertstrain.org, di situ tertulis cukup lengkap. Bahan-bahan yang diperlukan umumnya mudah didapat di toko-toko bahan kimia atau lewat supplier dari produsen bahan kimia yang umum (Sigma, Merck, Invitrogen, Promega, dll).
Semoga bisa membantu…
artikelnya bagus bgt..sangat membantu penelitian saya…
saya mw tanya,,untuk masuk ke tahap PCR apa ada syarat2 khusus spt kemurnian DNA atau konsentrasi DNA tertentunya? atau klo dlm proses elektroforesis DNA sudah terdeteksi bisa langsung masuk ke tahap PCR??
terima kasih
Halo Fitri,
Idealnya, DNA yang akan digunakan sebagai template untuk PCR harus memiliki kuantitas dan kualitas yang baik. Soal kuantitas, secara teoritis 1 molekul DNA pun sudah bisa digunakan sebagai template, karena setelah proses siklus PCR akan diperoleh salinan sebanyak 2 pangkat n kali lipat (kalau 30 siklus berarti 2 pangkat 30), jumlah yang sangat besar.
Dalam praktiknya, ada patokan tertentu yang bisa dipakai. Jika sample DNA berupa DNA genom, maka jumlah yang diperlukan kira-kira 50 – 200 ng saja, jadi kalau konsentrasi DNA genomnya 100 ng/uL, berarti diperlukan kira-kira 0.5 – 2 uL.
Soal kualitas, sebaiknya DNA memiliki kemurnian yang mencukupi, yaitu bisa dilihat dari pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 260, 230 dan 280 nm. DNA yang baik harus memiliki rasio A260/A280 antara 1.8 – 2.0, dan rasio A260/A230 sekitar 2.0.
Elektroforesis juga dapat membantu melihat kemurnian DNA, karena jika ada pengotor protein, maka akan terlihat pita yang “smear” pada gel, dan jika terdapat kontaminasi RNA, akan terlihat sebagai band yang “blur” di bagian bawah.
Tapi kadang-kadang pada praktiknya, DNA yang sangat sedikit (tidak terlihat di gel) dan tidak terlalu murni atau sulit untuk dimurnikan pun bisa juga digunakan sebagai template untuk PCR dengan melakukan optimasi dalam kondisi-kondisi PCR lainnya.
Bagaimana? semoga dapat membantu ya..
terima kasih….
infonya sangat membantu….
ada yg mw saya tanyakan lagi…
dalam proses elektroforesis hasil PCR jika kita menggunakan beberapa sampel negatif dan ada satu sampel positifnya.
sudah tentu yg sampel positif akan terdeteksi pada daerah yg sesuai ukurannya karena pd proses PCR, DNA nya akan teramplifikasi dengan primer yg memang khusus untuk sampel positif itu.
yg mw saya tanyakan, pada sampel negatif itu juga muncul pita pada gel, itu pita apa ya?apa pada proses PCR DNA sampel yg negatif itu juga teramplifikasi dengan primer yang hanya cocok pada sampel positif??atau apa?
satu lagi, pada proses PCR nya sendiri saat proses annealing, apa yg terjadi dg sampel negatif tsb??apa primer yang khusus untuk sampel positif itu juga menempel pada sampel negatif di urutan DNA yg komplemen tapi tidak memperpanjang?atau gimana?
terima kasih…jawabannya sangat ditunggu
Pengertian sample negatif bisa ada beberapa, yaitu sampel DNA tertentu yang diketahui tidak mengandung fragmen/gen target primer, atau sampel reaksi PCR dimana kita tidak menambahkan DNA template sama sekali, ini dinamakan Non Template Control (NTC).
Idealnya kedua macam sampel negatif ini tidak akan menghasilkan pita DNA pada ukuran tertentu yang sesuai ukuran DNA target. Sampel negatif jenis pertama masih memungkinkan untuk terbentuknya pita DNA pada ukuran yang tidak sama dengan ukuran target, ini terjadi jika primernya tidak benar-benar spesifik. Sedangkan pada negatif jenis kedua, yaitu NTC, seharusnya tidak terbentuk pita sama sekali, karena kita tidak menambahkan DNA template, kalaupun ada paling-paling pita dari primer-dimer yang terbentuk akibat perpanjangan primer.
Jadi sebetulnya jika pada sampel negatif terbentuk pita, bisa saja diterima asalkan ukurannya tidak sama dengan ukuran target.
terima kasih jawabannya, untuk sample negatif jenis pertama terbentuknya pita dimungkinkan karena adanya ikatan dimer antar primer. Pada penelitian saya, hasil PCR dari sample positif berbentuk pita pada daerah 190bp tapi yang sample negatif terbenyuk pita di daerah yang lebih besar sekitar 300an bp. Yang mau saya tanyakan, kenapa ukuran sample nagatif lebih besar dari yang positif jika mungkin yang terbentuk itu ikatan dimer antar primer? atau ada alasan lain mengapa hasil PCR sample negatif berukuran lebih besar daripada sample positif?
terima kasih
Jika kasusnya sample negatif jenis pertama, memang mungkin saja terbentuk primer dimer, tapi biasanya ukurannya sangat kecil (sekitar 100bp atau lebih kecil). Jika terbentuk pita dengan ukuran yang lebih besar, kemungkinannya adalah primer kita tidak spesifik, sehingga bisa mengamplifikasi daerah lain pada DNA. Makanya dalam kasus yang mbak alami pitanya terbentuk pada 300an bp, padahal pita positifnya 190 bp. Sebetulnya, terbentuknya pita pada sampel negatif masih bisa ditolerir asalkan ukurannya tidak sama dengan pita sample positif, yang penting pada 190 bp tidak terbentuk pita sama sekali.
terima kasih jawabannya….
untuk sampel negatif yg jenis pertama, terbentuknya pita dimungkinkan krn adanya ikatan dimer antar primer.
pada penelitian saya, hasil PCR dari sampel positif terbentuk pita pada daerah 190bp tapi yang sampel negatif terbentuk pita didaerah yang lebih besar sekitar 300an bp. yang mw saya tanyakan, knp ukuran sampel negatif lebih besar dari yg positif jika mungkin yg terbentuk itu ikatan dimer antar primer?atau ada alasan lain mengapa hasil PCR sampel negatif berukuran lebih besar drpd sampel positif? terima kasih…
2 Trackbacks
[...] http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular/ [...]
[...] http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular/ [...]