Kontrol dalam TA Cloning; Repot Tapi Penting

Membuat kontrol eksperimen memang merepotkan, tapi eksperimen tanpa kontrol ibarat mencari koin yang jatuh di kegelapan.

Dalam setiap eksperimen, kontrol merupakan salah satu faktor yang amat sangat penting. Interpretasi hasil eksperimen akan sangat sulit bahkan tidak mungkin dilakukan tanpa kontrol. Tak terkecuali dalam eksperimen TA Cloning.

Bagi kita yang bergelut di bidang biologi molekuler khususnya genetic engineering pasti tak asing dengan istilah TA Cloning. Eksperimen ini umum dilakukan untuk membuat fragmen DNA seperti produk PCR menjadi DNA sirkuler (plasmid). PCR produk yang ujungnya memiliki A overhang –tergantung enzim Taq Polymerase yang digunakan saat PCR– diligasikan (disambungkan) ke suatu vector yang memiliki T overhang, A dengan T jadi klop berpasangan. Dengan bantuan enzim DNA Ligase maka vektor dan PCR produk bisa tersambungkan menjadi plasmid alias DNA sirkuler. Plasmid ini bisa digunakan untuk berbagai keperluan, diantaranya mengklon gen suatu organisme ke organisme lainnya.

Kembali ke masalah kontrol eksperimen, sebagian orang beranggapan membuat kontrol hanyalah pemborosan waktu, energi dan biaya. Padahal tanpa adanya kontrol, maka tak ada cara simpel lain untuk mengetahui seberapa baguskah sel yang kita gunakan. Dan begitu keesokan harinya kita mendapati plate tanpa koloni putih, kita akan bingung, apakah sel yang kita gunakan tidak kompeten? Apakah transformasinya yang gagal? Atau ligasinya yang error? Kerja kita seharian akan jadi sia-sia saja.

Kontrol yang diperlukan

Agar hal itu tidak terjadi, tak apalah kita repot sedikit untuk membuat beberapa kontrol berikut:

1. Kontrol Ligasi Vektor

Dalam TA Cloning, seringkali kita khawatir terjadinya self-ligation vektor itu sendiri tanpa adanya insert. Jika metode blue-white screening yang kita gunakan, boleh jadi kita mendapati beberapa koloni putih yang sebetulnya tidak memiliki insert.

Meskipun koloni putih seperti ini biasanya tidak lebih dari 1 – 2% saja dari total koloni, tapi dengan adanya kontrol ligasi vektor (vektor + enzim ligase tanpa insert) kita akan punya gambaran seberapa besar background yang akan kita temukan dalam plate eksperimen.

2. Kontrol Transformasi

Setiap kali vial sel bakteri dikeluarkan dari freezer penyimpanannya, maka perlu dilakukan kontrol transformasi dengan cara mentransformasi plasmid utuh dengan jumlah tertentu ke dalam sel bakteri tersebut.

Kontrol transformasi akan memberi informasi penting berikut:

• apakah sel bakteri yang kita gunakan masih kompeten
• apakah plate media yang digunakan masih cukup fresh untuk menumbuhkan bakteri
• apakah seluruh tahapan kerja yang kita lakukan sudah benar

3. Kontrol Positif

Untuk meyakinkan apakah seluruh komponen bekerja dengan baik, kita bisa menggunakan insert dan vektor yang sebelumnya telah berhasil diligasikan dan ditransformasikan. Atau bisa juga menggunakan kontrol positif yang biasanya disertakan dalam kit TA Cloning.

Jadi dengan adanya kontrol kita bisa tahu faktor penyebab jika terjadi kegagalan dalam TA Cloning ini. Selanjutnya faktor tersebut lah yang harus kita perbaiki ketika mengulang eksperimen.

Tips seputar TA Cloning

Untuk mengurangi risiko kegagalan, berikut ini ada beberapa tips yang mungkin bisa membantu:

1. Buffer ligase harus di-thaw dan di-mix sempurna sebelum digunakan. Biasanya terdapat endapan putih salah satu komponen dalam buffer ligase, pastikan endapan tersebut terlarut sempurna sebelum digunakan. Pelarutan bisa dibantu dengan inkubasi selama 2 menit pada waterbath suhu 37C.

2. Hindari freez-thaw sel kompeten berulang-ulang, karena bisa mengurangi kemampuannya. Usahakan mengaliquot sel kompeten dengan volume yang cukup untuk satu kali transformasi saja.

3. Gunakan plate yang fresh. Jangan gunakan plate yang disimpan pada suhu 4C lebih dari satu minggu. Jangan pula menambahkan antibiotik ketika cairan media agar masih panas. Hangatkan plate terlebih dahulu pada suhu 37C selama 30 menit sebelum dilakukan plating.

Wah, Semuanya Biru

Jika yang kita peroleh pada plate hanya koloni biru, memang kemungkinannya adalah tidak ada insert pada plasmid yang kita transformasikan. Tapi ada beberapa kemungkinan lain yang tidak kita sadari:

1. Ukuran insert kita terlalu kecil untuk membuat gen lacZ terinaktifasi.

2. Insert kita ada pada posisi in-frame dengan gen lacZ sehingga lacZ-nya tetap aktif.

Dalam kedua kasus di atas, mungkin kita akan menemukan koloni-koloni biru yang warnanya lebih muda dibanding koloni biru lain yang lebih gelap. Artinya meskipun prosedur kloning sudah berjalan dengan baik namun insert kita ukuran dan framenya tidak pada posisi yang tepat untuk membuat koloni menjadi putih. Jika kita men-screening koloni biru muda, mungkin saja kita akan menemukan klon yang diharapkan di sana.

3. Insert yang kita klon bersifat meracuni (toxic) bagi sel bakteri host-nya. Kadang-kadang inkubasi pada suhu 30C (normalnya 37C) bisa membantu mengurangi efek toxic ini.

Bagaimana dengan pengalaman Anda dalam TA Cloning? Apakah ada tips lain yang belum tercakup di sini? Kita tunggu comment-nya ya.

Other articles you may like:

• 9 Tips untuk Real-Time PCR
• Teleportasi; Metode Transportasi Masa Depan
• Stem Cell dan Dunia Research
• JoVE: Katakan dengan Video
• Kegunaan Modeling Protein dalam mengembangkan agen terapetik
• Yang Wajib Anda Ketahui Tentang Pipet
• 6 Faktor Penting dalam Reverse Transcriptase PCR