Menambahkan Ekor “A” pada Produk PCR Blunt

Produk PCR dapat diklon ke suatu vektor melalui “permainan gunting dan lem DNA” seperti yang pernah kami bahas sebelumnya. Ada beberapa pendekatan yang dapat dilakukan, yaitu melalui “blunt end” cloning, “TA” cloning dan “sticky end” cloning. Cara mana yang harus kita pilih? Yuk kita lihat apa untung rugi ketiga cara tersebut.

PCR produk diperoleh dari proses amplifikasi suatu fragment DNA yang diapit oleh sepasang primer dengan bantuan enzim DNA polymerase yang termostabil. (Anda bisa merefresh pemahaman tentang PCR di sini). Beberapa enzim seperti Taq DNA Polymerase akan menambahkan satu basa nukleotida tambahan di ujung 3′ dari produk PCR. Biasanya yang ditambahkan adalah adenin (A) yang menyebabkan kedua ujung produk PCR memiliki “A” overhang. Namun enzim lain yang memiliki aktifitas proofreading seperti Pfu dan Tli DNA Polymerase tidak menambahkan “A” sehingga produk PCR memiliki ujung blunt.

Ligasi antara produk PCR yang blunt dengan vektor yang juga blunt akan lebih sulit karena tidak dibantu dengan penempelan antar ujung overhang. Selain itu kemungkinan terjadinya kesalahan penempelan akan lebih besar, karena bisa saja yang menempel adalah sesama produk PCR atau sesama vektor, padahal yang kita mau klonkan adalah produk PCR dengan vektornya.

Kloning Vektor T

Untuk mengatasi kesulitan tersebut, produk PCR yang memiliki ujung “A” overhang bisa menjadi pilihan. Proses ligasi akan berjalan lebih mudah karena sebelum proses ligasi, produk PCR sudah akan menempel dengan vektor yang memiliki ujung “T” overhang. (Ingat, A dengan T akan berpasangan bukan?). Omong-omong, vektor dengan ujung T overhang (biasa disebut vektor T) bisa diperoleh dengan mudah secara komersial maupun hasil produksi sendiri.

Setelah jadi, insert dapat dengan mudah “diambil” dari vektornya dengan menggunakan enzim restriksi tertentu dan ditransfer ke vektor-vektor lain sesuai keperluan.

Lalu bagaimana jika produk PCR kita sudah terlanjur blunt end? Adakah cara untuk membuatnya memiliki ujung A overhang? Tentu saja ada, ada kemauan pasti ada jalan, bukan begitu?

Reaksi Penambahan Ekor A ke Ujung Blunt

Berikut ini adalah metode sederhana untuk menambahkan satu basa A ke ujung 3′ pada produk PCR agar bisa digunakan dalam kloning vektor T. Yang kita butuhkan adalah:

• Produk PCR dengan ujung blunt
• dATP
• Enzim DNA Polymerase tanpa aktifitas proofreading, seperti Taq DNA Polymerase
• Reagent pendukung lain

Selain produk PCR, fragment DNA hasil pemotongan enzim restriksi blunt end pun dapat dibuat memiliki ujung A overhang dengan cara ini.

Siapkan reaksi berikut ini dalam tabung PCR:

• Fragment DNA dengan ujung blunt sebanyak 1-4 µl (produk PCR atau hasil restriksi)
• Buffer PCR hingga konsentrasi akhir 1X (untuk buffer 10X, maka tambahkan 1/10 volume reaksi)
• dATP hingga konsentrasi akhir 0.2 mM (untuk dATP 1 mM, tambahkan sebanyak 2 µl untuk reaksi 10 µl)
• Taq DNA polymerase sebanyak 5 unit
• MgCl₂ hingga konsentrasi akhir 1.5 mM (untuk MgCl₂ 25 mM, tambahkan sebanyak 0.6 µl untuk reaksi 10 µl)
• Air bebas nuklease hingga volume total 10 µl

Inkubasi pada suhu 70°C selama 15-30 menit pada water bath atau mesin thermal cycler (PCR). Setelah reaksi selesai, 1-2 µl produknya dapat digunakan untuk reaksi ligasi dengan vektor T tanpa perlu dipurifikasi terlebih dahulu.

Beberapa Tips untuk Kloning Vektor T

Hal-hal berikut mesti diperhatikan agar diperoleh hasil yang optimal:

• Hindari nuklease sebisa mungkin, karena dapat mendegradasi T overhang pada vektor. Gunakan selalu air bebas nuklease serta peralatan yang bersih dan steril.
• Gunakan sel kompeten dengan efisiensi tinggi (≥1 × 10⁸ CFU/μg DNA) untuk transformasi. Soalnya tingkat efisiensi ligasi A-T tergolong rendah karena yang overhang hanya 1 basa saja. Oleh karenanya, sel kompeten dengan efisiensi tinggi akan membantu kita mendapatkan jumlah koloni positif yang cukup.
• Jangan terlalu lama mengekspos produk PCR maupun vektor ke sinar UV (terutama UV pendek) untuk menghindari terbentuknya dimer pirimidin. Gunakan sinar UV panjang untuk visualisasi fragmen DNA. Selain itu, Anda bisa menggunakan lempeng kaca agar sinar UV tidak langsung mengenai fragemen DNA.

Ada komentar? Yuk kita share di sini.

References: Blog Promega

Other articles you may like:

• Bermain dengan ‘Gunting’ dan ‘Lem’ DNA
• Kontrol dalam TA Cloning; Repot Tapi Penting
• Cara Membuat Adapter Enzim Restriksi untuk Kloning PCR
• Sintesis Gen vs Cloning
• VecScreen; Membersihkan Sekuen dari Kontaminasi Vektor
• Mengenal PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Parameter Penting dalam Desain Primer

Tags: cloning ligase PCR TA cloning vector T