Mengenal PCR (Polymerase Chain Reaction)
Tentu Anda sudah mengenal yang namanya DNA. DNA ini sering disebut-sebut terutama berkaitan dengan kriminalitas, diagnosa penyakit, penentuan ‘keabsahan’ keturunan, dll. Mungkin Anda bingung bagaimana caranya polisi bisa mengungkap pelaku kejahatan dengan berbekal sehelai rambut pelaku yang tercecer di TKP, atau dari tetesan sperma pemerkosa yang mengering di tubuh korban. Padahal kan sampel yang dianalisa jumlahnya sangat sedikit, ajaib!
Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction. Proses yang berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 µl ini mampu menggandakan atau mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula. Maka pantes aja dengan berbekal DNA yang terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai kebutuhan kita.
Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase.
PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Nah, sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali, dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup, 2 pangkat 30 alias 1.073.741.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu, kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi, tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.
 Sumber: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrcopies.gif
|
Komponen PCR
Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:
Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.
dNTP (deoxynucleoside triphosphate)
dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.
Buffer
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.
Ion Logam
- Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.
- Ion logam monovalen, kalsium (K+).
Tahapan Reaksi
 Sumber: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrsteps.gif
|
Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:
Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.
Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.
Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.
Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:
Pra-denaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).
Final Elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir
PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.
Aplikasi teknik PCR
Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:
Isolasi Gen
Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu apaan ya?
Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.
Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.
Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga [http://www.littletree.com.au/dna.htm]. Dan ajaib! Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi.
Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
DNA Sequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.
Forensik
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.
Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.
Diagnosa Penyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.
PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.
Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun setelah penemuannya (1993).
Sumber: Wikipedia, Andy Vierstraete dan sumber-sumber lainnya.
Other articles you may like:
- Menambahkan Ekor “A” pada Produk PCR Blunt
- 6 Faktor Penting dalam Reverse Transcriptase PCR
- 9 Tips untuk Real-Time PCR
- Yuk Mendesain Primer dengan Primer3Plus
- Parameter Penting dalam Desain Primer
- Cara Membuat Adapter Enzim Restriksi untuk Kloning PCR
- Mengenal Teknik DNA Sequencing
30 Comments
kalau kegunaan pcr dalam rekayasa bakteri apa ya??
mungkin yg dimaksud rekayasa bakteri adalah memasukkan gen-gen tertentu ke dalam bakteri ya?
kalo itu pcr sangat berguna sekali, salah satu caranya seperti ini:
- pertama kita amplifikasi gen-gen tertentu yang kita mau masukkan/klon dengan teknik PCR.
- Hasil amplifikasi/PCR tersebut bisa kita insersi ke dalam vektor kloning (dgn bantuan enzim restriksi dan ligasi)
- kemudian vektor kloning yang sudah positif memiliki insert (gen) bisa dimasukkan ke dalam bakteri (mis. melalui transformasi atau konjugasi) sehingga gen tersebut bisa terekspresi pada bakter tersebut.
Nah, jadi deh bakteri yang sudah direkayasa alias memiliki gen ‘asing’ yang diambil dari makhluk hidup lain..
Semoga bisa membantu…
kalau microarray itu apa ya?
Halo Dewi,
Kebetulan kita juga ada artikel mengenai microarrays, bisa dibaca di http://sciencebiotech.net/topics/biotechnique/microarrays/
Semoga bisa membantu memahami ttg microarrays
artikelny bagus…
saya mw tanya…pd proses PCR itu primer pasti bersifat spesifik..misalnya suatu primer A pasti ditargetkan ke gen A,, tapi jika sampelny gen B,,apa yg trjadi dg primernya??apa tetep nempel ke untai DNA singel strand yg urutannya sama?atau tidak??
lalu apa primer itu memperpanjang DNAnya?
intinya,,apa yg terjadi pd proses annealing jika primer spesifik A ditargetkan ke sampel DNA B??
Idealnya primer itu harus spesifik jika kita ingin mengamplifikasi hanya bagian tertentu saja (mis. Gen A), tapi spesifik tidaknya itu kan hanya dugaan kita melalui bantuan software perancang primer, dengan referensi database sekuen DNA yang ada di Genebank melalui program BLAST misalnya. Kita mengatakan primer tersebut spesifik terhadap gen A dengan argumen karena kita tidak menemukan urutan basa yang tepat berpasangan dengan primer A tersebut pada database yang sudah ada. Namun tidak menutup kemungkinan ada urutan basa yang sama pada DNA yang belum terdeposit datanya di Genebank.
Dalam kasus ini, jika Gen B sudah diketahui urutan basa DNA-nya, kita bisa memperkirakan apakah primer A tersebut akan menempel ke gen B atau tidak. Jika ada urutan basa pada Gen B yang berpasangan tepat sama dengan primer A, sudah barang tentu primer A bisa menempel pada Gen B, tapi jika tidak, maka primer tersebut tidak akan menempel pada bagian manapun di gen B.
Jika primer tidak menempel, sudah barang tentu tidak akan terjadi proses pemanjangan atau polimerisasi atau pengkopian DNA, dengan kata lain proses PCR tidak terjadi. Karena syarat agar reaksi PCR terjadi, salah satunya adalah adanya primer yang menempel pada template DNA, minimal ada sebagian dari ujung 3′ primer yang menempel pada template DNA.
pak Yepy yg terhormat,
saya mau mengetahui lebih jauh mengenai aplikasi PCR dan beberapa mengembangan metode PCR dalam dunia veteriner….. mohon penjelasannya. dan alamat (situ) lain yg dapat sy kunjungi.
Terima kasih atas tanggapannya.
Dalam dunia veteriner, banyak sekali digunakan teknik PCR, misalnya untuk mendeteksi/diagnosis suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri/jamur/virus. Misalnya penyakit WSSV pada udang, dengan PCR kita bisa mendeteksi keberadaan virus WSSV sejak dini, karena teknik PCR memiliki tingkat sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi.
Selain itu banyak juga riset-riset berbasis PCR, seperti melihat pengaruh pakan ternak jenis tertentu terhadap komunitas mikrobiota pada usus hewan, sehingga akhirnya kita bisa melihat apa pengaruh pakan tersebut terhadap kesehatan hewan tersebut.
Saya kira masih banyak aplikasi PCR untuk dunia veteriner. Mudah2an bisa kami bahas di lain kesempatan.
bagaimana memastikan hasil ekstraksi berupa RNA template benar-benar RNA dari Virus VNN (viral nervous necrosis-virus pada ikan laut). Ada yg bilang dna sequensing, spektrofotometer, or RNA template di elektroforesis.
tolong referensinya donk
thanks
Ada beberapa cara yang bisa dilakukan, diantaranya:
- RNA hasil isolasi Virus VNN diubah menjadi cDNA dengan reaksi Reverse Transcriptase PCR (lihat Artikel kami tentang RT PCR). Kemudian cDNA-nya di-PCR menggunakan primer spesifik untuk virus VNN. Mas harus mengecek dulu apakah ada orang yang sudah merancan primer khusus yang bisa mengamplifikasi bagian tertentu pada virus VNN tadi. Jika tidak, maka kita yang harus merancangnya berdasarkan referensi sekuen RNA virus yang terdapat pada genbank.
- Untuk lebih meyakinkan lagi, produk PCR tadi (jika positif/ada), ditentukan urutan basa-nya dengan teknik DNA Sequencing. Selanjutnya urutan basa tersebut dibandingkan dengan database yang ada di Genbank menggunakan program BLAST. JIka cocok atau memiliki kemiripan yang tinggi (di atas 75%), kita bisa menduga kuat bahwa RNA virus yang kita isolasi adalah benar-benar VNN. Untuk lebih jelas mengenai teknik DNA Sequencing, bisa diklik di sini atau di sini.
Teknik spectrophotometer dan elektroforesis hanya digunakan untuk mengukur kuantitas dan kualitas RNA secara total, tidak bisa memastikan apakah RNA tersebut berasal dari virus VNN ataukah bukan.
Demikian mas, semoga membantu.
sedang cari bhn tg etio dr pierre robin sindrom…salah satunya mutasi atau regulasi dari SOX9 dan KCNJ2,hasil didapat dr analisa kromosom….metodenya pcr jg…bs bantu jelasin ga cara kerjanya…ambil sampel…trus…analisa trus…ketahuan ada mutasi…thank bgt jk bs bantu
Halo risdawati.. thanks udah bertanya.. saya coba jawab sebisanya, soalnya data yang diberikan sangat terbatas ya..
Secara umum, urutan kerjanya sebagai berikut:
- Pengambilan sampel yang memiliki fenotip berbeda, artinya sampel yang sehat dan yang sakit.
- Diekstrak DNA dari sel tertentu (darah, cairan tubuh lain, jaringan?)
- Dilakukan analisa PCR menggunakan primer yang mengamplifikasi gen yang kita bidik, yaitu gen SOX9 dan KCNJ2. Primer ini bisa dirancang sendiri sesuai data pada GenBank atau jurnal-jurnal yang telah dipublikasi sebelumnya.
- Untuk mengetahui ada mutasi atau tidaknya, maka harus dilakukan analisa DNA sequencing terhadap produk PCR yang diperoleh.
- Dilakukan perbandingan antara sekuen DNA sampel yang sehat dan yang sakit. Dari situ dapat dilihat apakah ada mutasi atau tidak, dan untuk melihat apakah mutasi itu berhubungan dengan penyakit ataukah tidak, maka harus merujuk pada referensi lain yang menyatakan pada posisi mana mutasi itu berada.
Sebetulnya, jika sudah diperoleh primer PCR yang khusus untuk menganalisa mutasi seperti SNP (single nucleotide polymorphism), mungkin tidak diperlukan analisa DNA sequencing lagi, tetapi bisa langsung dilihat perbedaan antara produk PCR dari sampel yang termutasi dan yang tidak. Namun sekali lagi, ini harus dilihat dari penelitian sebelumnya jika mungkin ada yang sudah pernah melakukannya untuk gen yang dimaksud.
Demikian, semoga jawabannya bisa membantu.
kok halaman ini g bisa di save ya ?
terus bahan bahan yang digunakan dalam proses PCR ini apa aja ?
trus fungsi dari bahan2 tersebut apa aja.?
makasi yaa sebelumnya
Halo Ranger Kuning,
semestinya bisa di-save ya.. mungkin bisa dipastikan FILE TYPE ketika menyimpan halaman ini, coba saja jenis ‘HTML’ atau ‘HTML with images’ jika ingin menyimpan gambar-gambarnya juga.
Komponen utama PCR adalah:
- Enzim DNA Polimerase, untuk mensintesa/memperpanjang rantai DNA
- Buffer PCR sebagai penunjang agar Enzim DNA polimerase dapat bekerja
- Ion Mg2+ sebagai kofaktor Enzim DNA Polimerase
- dNTP sebagai “building block” dapat sintesa/perpanjangan rantai DNA baru
- Primer sebagi inisiator atau yang mengawali terbentuknya rantai baru DNA
- Template atau cetakan DNA yang akan diperbanyak/diamplifikasi
kira2 pengaplikasian PCR ini di laboratorium klinis seperti apa? misalnya di laboratorium klinik yang pada umumnya melaksanakan pemeriksaan hematologi, kimia darah, urinalisa, serologi dan imunologi yang digunakan check up kesehatan sehari-hari?
mohon informasinya.
Halo Eskarini,
Sorry baru reply..
Di lab klinis saat ini penggunaan PCR sudah semakin luas. Mulai dari deteksi virus/bakteri penyebab penyakit hingga deteksi kanker. Dengan PCR, diagnosa bisa lebih spesifik karena yang dibidik adalah bagian tertentu dari DNA virus/bakteri misalnya, yang benar-benar khas bagi mereka dan tidak ada pada spesies-spesies lainnya. Bahkan dengan quantitative PCR atau Realtime PCR, analisa bisa dilakukan secara kuantitatif. Setahu saya di banyak lab klinis di Indonesia sudah menerapkan teknologi PCR ini.
maaf.. stelah itu kan ada tahap elektroforesis… gimana step-stepnya?
mohon jawabannya,,
terima kasih..
Secara umum langkah-langkah elektroforesis DNA hasil PCR adalah sebagai berikut:
Membuat gel, biasanya gel agarose dengan konsentrasi sesuai dengan panjang produk PCR (misal 0.7%, 1%, 1.5% atau 2%) pada cetakan khusus
Gel ditempatkan di dalam tanki elektroforesis yang berisi buffer (mis. TAE = Tris-Acetate-EDTA)
Memasukkan produk PCR pada well (sumur) gel. Larutan produk PCR sebelumnya dicampur dengan Loading Dye agar dapat masuk ke dalam well (sumur). Jangan lupa menyertakan DNA Size Marker/Ladder
Jalankan elektroforesis dengan memberi tegangan listrik, biasanya sebesar 60 – 100 Volt selama kira-kira 30-60 menit. Ini bergantung pada ketebalan gel, ukuran PCR produk
Setelah selesai, gel direndam dalam zat pewarna DNA, misalnya Ethidium bromida agar DNA dapat divisualisasikan
Visualisasikan DNA yang sudah dipisahkan dengan elektroforesis di bawah sinar UV
Gambar hasil visualisasi diabadikan dengan kamera digital untuk selanjutnya dianalisa
Artikel tentang elektroforesis dapat dibaca di Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular
Yth. mas Yeppy
Saya sering mengalami kendala ketika bekerja dengan PCR. Mohon penjelasannya
1.apa penyebab smear mas? bagaimana mengatasinya?
2. apakah ekstrak DNA yang kita amplifikasi dan menghasilkan smear masih bisa digunakan lagi untuk amplifikasi dengan harapan single band terbentuk?
3. bagaimana caranya kita tahu kualitas DNA yang dihasilkan baik dan layak untuk diamplifikasi?
Thanks mas Yeppy
Yth. Mbak Niken, Maaf br reply,
1. Smear bs disebabkan bbrp hal, yang terutama adalah pengotor berupa protein, biasanya akibat template genom DNA utk PCR yang masih kotor dan terlalu banyak ditambahkan. Utk itu jangan menambahkan template terlalu banyak Dan bila perlu bisa diencerkan dulu sebelum digunakan sebagai template PCR. selain itu smear jg bisa disebabkan banyaknya produk unspecific sehingga terlihat smear, kalau yg ini bisa diatasi dengan optimasi suhu dan siklus PCR atau merancang primer baru jika optimasi gagal.
2. Kalau smearnya akibat protein mungkin bisa digunakan lg dan terbentuk singel product. Tapi kalau smear krn banyak produknya yg tdk spesifik maka cara ini tdk bs dilakukan krn akan terbentuk produk yg smear lagi.
3. Caranya dengan mengukur absorbansinya pada pjg gelombang 260, 280 dan 230 nm menggunakan spectro atau nanodrop. Lalu dilihat konsentrasi dan tingkat kemurniannya. Selain itu bisa jg dgn me-run pada elektroforesis gel dan diamati ada tidaknya band DNA dan pengotor2nya.