Mengenal Teknik DNA Sequencing
Bagaimana prinsip analisa DNA Sequencing berbasis Sanger Method yang fenomenal dan kini menjadi andalah jutaan ilmuwan di seluruh dunia?
DNA Sequencing (Image from servicexs.com)
Informasi genetik pada suatu makhluk hidup tersimpan pada DNA-nya. Nah, untuk mengetahui informasi genetik tersebut digunakan teknik DNA Sequencing, yaitu metode yang digunakan untuk menentukan urutan basa nukleotida (adenine, guanine, cytosine dan thymine) pada molekul DNA. Saat ini teknik DNA Sequencing sudah memasuki tahap baru yang mengarah pada large scale atau high-throughput sequencing, jutaan bahkan miliaran basa nukleotida DNA dapat ditentukan urutannya dalam sekali run saja.
Meskipun begitu, teknik lama berbasis chain-termination masih umum digunakan, bahkan sangat efisien untuk menentukan sekuen DNA fragmen pendek (masih dalam hitungan kilobasa). Jadi ditemukannya teknik DNA Sequencing yang lebih canggih tidak serta merta bakal menggusur mesin-mesin capillary sequencing yang sudah “merajalela” di berbagai laboratorium biologi molekuler di seluruh dunia.
Artikel ini akan membahas prinsip dasar dan protokol DNA sequencing berbasis metode chain-termination menggunakan mesin automated capillary sequencer.
Prinsip Dasar DNA Sequencing
DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.
Proses Cycle Sequencing (Image from appliedbiosystems.com)
Jadi yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:
- Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang) seperti PCR
- ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan menghilangkan gugus 3′-OH pada ribosa.
Struktur molekul dNTP dan ddNTP, perhatikan bedanya (Image from csa.fi.it)
Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya. Nah, jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3′-OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus 5′-Posfat dNTP berikutnya membentuk ikatan posfodiester.
Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa. Lalu bagaimana caranya menentukan urutan basa DNA dari produk cycle sequencing ini?
Cara Klasik
Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.
Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut dilarikan pada gel electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah. Urutan basa DNA dapat ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling bawah (paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang digunakan dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan dNTP.
Prinsip Sanger Method dengan primer labelling (Image from noaa.gov)
Dye Primers dengan Label Berbeda
Agar proses pemisahan fragmen pada gel electrophoresis bisa digabung dalam 1 lajur saja, digunakanlah pelabel fluorescent dengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi cycle sequencing.
Prinsip Sanger Method dengan primer fluorescent labelling yang berbeda-beda (Image from appliedbiosystems.com)
Dengan teknik ini visualisasi dan penentuan urutan basa dapat dilakukan dengan lebih mudah karena keempat reaksi dipisahkan dalam satu lajur electrophoresis dengan 4 warna berbeda. Coba bandingkan cara ini dengan cara sebelumnya, lebih mudah mana membacanya?
Pembacaan sekuen DNA, lebih mudah mana? (Image from wikipedia.org)
Dye-Terminators Sequencing
Cara yang lebih simple akhirnya ditemukan juga. Para ilmuwan cerdas menemukan cara untuk melabel ddNTP dengan 4 label fluorescent yang berbeda-beda untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan demikian, reaksi cycle sequencing dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan dirun pada satu lajur gel electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat.
Prinsip Sanger Method dengan dye dideoxy terminator (Image from appliedbiosystems.com)
Dengan ditemukannya mesin Automated Capillary Sequencer, proses pemisahan fragmen dan pembacaan urutan basa DNA dapat dilakukan dengan lebih simple, cepat dan terotomatisasi. Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi, mulai dari 1, 4, 16, 48 hingga 96 kapiler dalam satu mesin, semakin banyak jumlah kapiler, semakin banyak pula jumlah sampel DNA yang bisa ditentukan urutan basanya.
Hasil pembacaan mesin sequencer disebut electropherogram, yaitu peak-peak berwarna yang menunjukkan urutan basa DNA-nya.
Contoh Electropherogram (image from ggpht.com)
Teknik DNA Sequencing yang berbasis fragment analysis saat ini tidak hanya digunakan untuk menentukan urutan basa-basa DNA semata, tapi bisa dikembangkan untuk berbagai aplikasi, seperti penentuan SNP (Single Nucleotide Polymorphism), analisa keragaman genetik seperti DNA Microsatellite dan AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), community analysis seperti tRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) dan segudang aplikasi lainnya. Banyaknya aplikasi DNA Sequencing kapiler ini menunjukkan bahwa metode ini –meskipun kini tergolong “lambat” setelah ditemukannya high-throughput sequencing– akan tetap jadi primadona dan andalan para life-scientist di seluruh dunia. Dan tak heran pula jika Frederick Sanger menerima hadiah Nobel bidang kimia untuk kedua kalinya di tahun 1980 atas penemuannya ini.
Sumber:
- Wikipedia
- Applied Biosystems
- Sumber-sumber lainnya
Other articles you may like:
- Faktor Penentu Keberhasilan Analisa DNA sequencing
- Tanya Jawab Seputar Analisa DNA Sequencing
- Mengenal PCR (Polymerase Chain Reaction)
- Replikasi DNA
- DNA Sudoku
- Interpretasi Electropherogram DNA Sequencing
- Sequence Alignment di BioEdit
Blog yg bagus dan mudah dimengerti, izin link n editing artikelnya ya Pak. Nuwun…
Thanks atas commentnya… moga bermanfaat. sering-sering mampir ya..
pak, saya tertarik dengan artikel penanganan limbah agarose dan ETbr. Bisa bantu untuk artikel yang lebih lengkap tentang limbah agarose dan Etbr. kebetulan saya kerja di Lab PCR. Trims pak
Halo mbak, untuk menangani limbah EtBr, tergantung dari jenis limbah dan konsentrasi EtBr-nya. Apakah dia berbentuk larutan (mis. utk staining), apakah tercampur dlm gel, apakah terkontaminasi pada sarung tangan, dll.
Uraian lengkapnya bisa dilihat pada situs berikut: http://web.princeton.edu/sites/ehs/chemwaste/etbr.html, kami belum sempat menuliskannya dalam bentuk artikel lengkap di Sciencebiotech.net…
Thanks buat commentnya mbak…
halo ka yepy n cempaka..aku juga lg penelitian pake PCR…pake agarose n et br juga….klo limbahnya aku rendam didalam air pemutih kaya Ba”*cli*….bener ga yah?
hmm… sepertinya cara perendaman dengan cairan pemutih/bleaching seperti itu tidak akan membantu. Jadi mesti dilakukan cara seperti yang sudah saya sampaikan pada comment sebelumnya.
Saya mintak yaa..buat tugas.hehe
makasi..
salam kenal
silakan.. moga bermanfaat.. salam kenal juga.. ^_^
makasih yah ka yeps atas ifonya..hehehe..oh iya boleh tanya lagi ga?…klo mau cari urutan DNA dari suatu gen itu gmna yah…katanya bisa liat di data base NCBI..cranya gmana yah? atau ada sumber informasi lain dimana saya bisa dapat urutan DNA dari gen yg saya ingin cari? terimaksih banyak sebelumnya ka…
Yup… NCBI memuat database urutan basa DNA yang dipublikasi dari seluruh dunia. Jadi, kalo kita mau cari urutan basa suatu gen memang disana tempatnya. Tinggal klik http://www.ncbi.nlm.nih.gov, trus di bagian “Search” (ada di posisi kiri atas), kita bisa tuliskan nama gen yang ingin kita cari, bisa juga disertai nama organismenya jika kita ingin hasil yang lebih spesifik. Nah, di sebelah atas kotak pencarian ada pilihan menu database, kita bisa memilih apakah database “gene” (untuk mencari data lengkap tentang gen tsb), bisa juga “nucleotide” (untuk langsung melihat sekuen basa DNA-nya), atau “protein” (melihat sekuen asam amino protein yang dihasilkan gen tersebut), dll. Pokoknya simple dan anti repot.
Selamat mencoba…
asalamuallaikum ka…udah kami coba untuk bukanya…tapi kami ga dapet sekuens DNA nya..entah karna kami yg ga ngerti cara carinya atau emag ga ada..kita udah ikutin langkah yang ka yepy kasih..udah sampe…
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7947364?ordinalpos=2&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Gene.Gene_ResultsPanel.Gene_RVDocSum
hasil cuma gitu dowang..hikhikhik.. ada saran lain ga ka? duh maaf bgt yah ka..kita tanya2 terus.. terimakasih ka…^^
Wa’alaikumussalam wr.wb.
Yup.. itu tinggal selangkah lagi… klik aja di bagian yang ada kode Accession Number (di situ tertulis NC_012731.1), lalu pilih salah satu format (FASTA, Genebank atau graphic), dapet deh sekuens-nya. Atau kalau mau sekuen proteinnya tinggal klik di grafik yang warna merah.
Gimana? bisa?
ass… Hahai..alahamdulillah bisa ka..hohoho..makasih yah…sekrang tinggal cr aja deh…makasiihhhhh bgt ka… makasiiih sekali,^^
keren bgt,,, mkcy bnyk membantu
sama-sama.. sering-sering mampir ya..
wah blog nya mantap banget nih buat orang awam seperti saya.
begini mas saya ada sedikit pertanyaan.
saya dapet tugas kuliah data mining, dapet topik nya tentang DNA Sequence. Jadi maaf ya kalau pertanyaan saya ini agak bodoh. maklum saya dari jurusan Teknik Informatika jadi buta banget sama yang ky ginian.
pertanyaannya: misal ada 2 buah virus ( A dan B ) yang memiliki Sekuen DNA yang hampir mirip, misal setelah di BLAST di NCBI dapet skor 80%.
dari kedua virus A dan B itu apakah ada kesamaan melihat dari sekuen DNA nya yang mirip? misal, perawatannya sama, atau obat2annya sama, atau setidaknya adakah pengaruh yang signifikan atas kemiripan Sekuen DNA tersebut?
mohon bantuannya ya pak, thanks banget.
Halo mas Hadyan…
Seperti kita tahu, DNA pada makhluk hidup dan virus merupakan sandi genetik yang menjadi cetak biru fungsi sel-selnya. Bagian DNA yang menyandikan protein disebut gen dan ada bagian lain yang memiliki fungsi lain seperti promoter, regulator dan bahkan ada yang disebut junk DNA karena diduga tidak ada fungsinya (meskipun bisa jadi justru kitalah yang belum tahu apa fungsinya).
Kemiripan sekuen DNA antar makhluk hidup bisa menunjukkan tingkat kemiripan mereka. Misalnya sekuen DNA antara bakteri dalam satu genus akan lebih mirip ketimbang dengan bakteri dari genus yang berbeda.
Jika DNA yang kita bandingkan adalah gen, maka tingkat kemiripan mereka bisa menunjukkan kemiripan fungsi gen tersebut, dengan kata lain semakin mirip sekuen gen tersebut maka protein yang disandikannya pun akan semakin mirip dan memiliki fungsi yang mirip juga.
Hubungannya dengan virus A dan B tadi, jika yang dibandingkan tadi adalah gen penyandi protein pada virus, maka bisa jadi berkorelasi dengan treatment atau pengobatan atas serangan virus tadi. Jadi saya kira data mining ini dapat membantu menduga atau mencari cara menangkal serangan virus berdasarkan sekuen DNA/RNA dari gen pada virus. Namun tentu saja untuk membuktikannya perlu dilakukan pengujian secara in vitro di laboratorium.
wah jelas sekali nih jawabannya.. terimakasih banyak ya kak..
nah dari jawaban tadi muncul satu pertanyaan lagi.. di jawaban kakak di sebut “Jika DNA yang kita bandingkan adalah gen”. nah pertanyaannya memang DNA sequence itu ada berapa macam?? lalu bagaimana cara membedakannya?? lalu untuk mendapatkan data dna sequence untuk gen virus di NCBI itu bagaimana caranya??
karena saya masih belum ngerti nih file dna sequence yang saya download ini tipe nya gen atau apa, karena saya tidak bisa membedakannya.
maaf ya kak ngerepotin terus. hehe.. mohon bantuannya lagi
Halo Hadyan,
Gen adalah bagian dari DNA yang menyandikan protein. Seperti telah sy singgung sebelumnya, tidak semua DNA menyandikan protein, ada bagian-bagian tertentu yang sampai saat ini belum diketahui fungsinya dengan jelas, sering disebut sebagai “Junk DNA”. (Walaupun saya nggak sreg dengan istilah ini karena saya yakin setiap yang diciptakan Allah pasti ada gunanya, termasuk “Junk DNA” Ini). Kalau di GenBank, jika pada sekuen itu disebutkan dia menyandikan protein tertentu, maka ia adalah gen. Misalnya seperti item GenBank berikut ini:
====================================
Hepatitis E virus isolate HEV-7203176-Mrs capsid protein gene, partial cds
GenBank: GQ240310.1
FeaturesSequence
LOCUS GQ240310 345 bp RNA linear VRL 30-JUN-2010
DEFINITION Hepatitis E virus isolate HEV-7203176-Mrs capsid protein gene,
partial cds.
ACCESSION GQ240310
VERSION GQ240310.1 GI:291575266
KEYWORDS .
SOURCE Hepatitis E virus
ORGANISM Hepatitis E virus
Viruses; ssRNA positive-strand viruses, no DNA stage; Hepeviridae;
Hepevirus.
REFERENCE 1 (bases 1 to 345)
AUTHORS Kaba,M., Richet,H., Ravaux,I., Moreau,J., Brouqui,P. and Colson,P.
TITLE Evidence of chronic hepatitis E in HIV patients
JOURNAL Unpublished
REFERENCE 2 (bases 1 to 345)
AUTHORS Kaba,M., Richet,H., Ravaux,I., Moreau,J., Brouqui,P. and Colson,P.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (03-JUN-2009) Pole des Maladies Infectieuses et
Tropicales Clinique et Biologique, Federation Hospitaliere de
Microbiologie Clinique, Centre Hospitalier Universitaire Timone,
264 Rue Saint-Pierre, Marseille 13385, France
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..345
/organism=”Hepatitis E virus”
/mol_type=”genomic RNA”
/isolate=”HEV-7203176-Mrs”
/isolation_source=”serum”
/host=”Homo sapiens”
/db_xref=”taxon:12461″
/country=”France”
/collection_date=”Apr-2007″
/note=”genotype: 3f”
CDS 345
/note=”ORF2″
/codon_start=2
/product=”capsid protein”
/protein_id=”ADE10199.1″
/db_xref=”GI:291575267″
/translation=”VMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTR
VSRYTSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLAD
TLLGGLPTELISS”
ORIGIN
1 tgttatgctt tgcatacatg gctcccctgt taattcctat accaacacgc cctatactgg
61 ggcattgggg ctcctcgact ttgcactcga gcttgaattt agaaatttga cccctgggaa
121 cactaacacc cgtgtgtccc gatatactag tacagcccgg caccgtttgc gtcgcggtgc
181 cgatgggaca gccgagctta caactactgc agccacacgt tttatgaagg acttgcattt
241 tactgggaca aatggtgttg gcgaggtggg ccgtggtata gccttaacgc tatttaatct
301 tgctgataca cttctcggcg ggctgccgac agaattgatt tcgtc
//
==========================================
Pada contoh di atas, disebutkan bahwa sekuen tersebut adalah sekuen virus yang menyandikan Capsid Protein, dan ada bagian FEATURE yang disebut CDS atau Coding Sequence, berarti itu adalah bagian dari DNA yang menyandikan protein dan oleh karena itu disebut GEN.
Untuk mendapatkan data DNA sequence gen virus, kita tinggal memasukkan kata kunci yang kita inginkan pada kotak pencarian. Insya Allah kita akan bahas topik ini dalam suatu tulisan khusus.
Begitu Mas Hadyan, semoga bisa membantu.