Parameter Penting dalam Desain Primer

Bila pada artikel “Yuk Mendesain Primer dengan Primer3Plus” dan “Desain Primer Menggunakan PerlPrimer” sudah dijelaskan tahapan dalam mendesain primer untuk PCR, maka dalam artikel ini kita akan mempelajari parameter apa saja yang harus kita perhatikan agar kualitas primer yang kita desain benar-benar terjamin. Beberapa hal berikut ini dapat kita jadikan bahan pertimbangan ketika mendesain primer.

Parameter untuk Masing-Masing Primer

1. Panjang Primer

Secara umum disepakati bahwa panjang primer PCR yang optimal adalah 18-22 bp. Panjang ini cukup panjang untuk mencapai spesifisitas yang cukup, dan cukup pendek bagi primer untuk terikat dengan mudah pada DNA template pada suhu annealing-nya.

2. Suhu Leleh Primer

Suhu leleh atau melting temperature (Tm) adalah temperatur dimana setengah dari duplex DNA akan terpisah menjadi utas tunggal dan Tm juga mengindikasikan stabilitas duplex.

Hasil terbaik biasanya diperoleh jika primer memiliki Tm 52-58 °C. Primer dengan nilai Tm di atas 65 °C memiliki kecenderungan untuk terjadinya annealing sekunder. Nilai Tm bisa diindikasikan dari GC content dan dapat dihitung secara akurat menggunakan rumus-rumus tertentu.

3. Suhu Annealing Primer (Ta)

Nilai Temperatur Leleh (Tm) merupakan estimasi stabilitas hibrid DNA-DNA dan penting untuk menentukan suhu annealing. Jika Ta terlalu tinggi maka akan menyebabkan hibridisasi primer-template yang kurang baik sehingga yield produk PCR pun akan rendah. Sebaliknya jika Ta terlalu rendah maka bisa menyebabkan banyaknya produk-produk non-spesifik karena akan terjadi banyak mismatch yang menurunkan spesifisitas PCR.

Bagaimana cara menghitung Ta? Berikut ini formulanya:

Ta = 0.3 x Tm(primer) + 0.7 Tm (produk) – 14.9

dimana,

Tm(primer) = Suhu Leleh (Tm) primer

Tm(produk) = Suhu Leleh (Tm) produk

4. GC Content

GC content (prosentase jumlah G dan C terhadap jumlah basa total pada primer) harus berkisar antara 40-60%.

5. GC Clamp

Ketika mendesain primer biasanya kita memilih primer yang memiliki G atau C pada posisi 5 terakhir ujung 3′, karena bisa meningkatkan ikatan spesifik pada ujung 3′ karena seperti kita tahu ikatan G atau C lebih kuat. Namun perlu dihindari lebih dari 3 basa G atau C pada 5 basa terakhir ujung 3′ karena ujung 3′-nya bisa melipat membentuk GC clamp yang mengakibatkan ujung 3′ primer tidak terikat pada template.

6. Struktur Sekunder Primer

Struktur sekunder primer dapat disebabkan oleh interaksi intra dan inter-molekuler primer. Hal ini juga amat mempengaruhi kualitas dan kuantitas produk PCR, karena akan mengurangi kemampuan primer menempel pada template.

Berikut ini beberapa jenis struktur sekunder primer:

i) Hairpins

Hairpins terbentuk akibat interaksi intramolekuler primer sehingga membentuk semacam lipatan. Biasanya hairpin ujung 3′ dengan ΔG -2 kcal/mol dan hairpin internal dengan ΔG -3 kcal/mol masih dapat ditoleransi.

Masih ingat ΔG? ΔG atau energi bebas Gibbs adalah ukuran jumlah kerja yang dapat diekstrak dari sebuah proses yang terjadi pada tekanan tetap. Ini merupakan ukuran kespontanan reaksi. Stabilitas hairpin biasanya direpresentasikan oleh nilai ΔG-nya, yaitu energi yang diperlukan untuk mengurai struktur sekunder. Semakin negatif nilai ΔG maka semakin stabil ia, tentu tidak kita inginkan. Adanya hairpin pada ujung 3′ sangat mempengaruhi reaksi.

ΔG = ΔH – TΔS

ii) Self Dimer

Self dimer terbentuk oleh interaksi intermolekuler antara dua molekul primer yang sama, dimana primer homolog terhadap dirinya sendiri. Biasanya kita menambahkan primer dalam jumlah besar dibanding jumlah DNA template, dan ketika primer lebih suka membentuk dimer intermolekuler ketimbang berhibridisasi dengan DNA template, maka yield produk tentu akan berkurang. Self dimer pada ujung 3′ dengan nilai ΔG -5 kcal/mol dan self dimer internal dengan nilai ΔG -6 kcal/mol biasanya dapat ditoleransi.

iii) Cross Dimer

Primer cross dimer terbentuk karena interaksi intermolekuler antara primer sense dan antisense, dimana keduanya memiliki homologi. Cross dimer pada ujung 3′ dengan nilai ΔG -5 kcal/mol dan cross dimer internal dengan nilai ΔG -6 kcal/mol biasanya dapat ditoleransi.

7. Repeats

Repeat adalah suatu di-nukleotida yang terjadi berulang-ulang secara berurutan dan harus dihindari karena mereka dapat menyebabkan mispriming. Contohnya: ATATATAT. Jumlah repeat maksimum yang dapat ditoleransi adalah 4 di-nukleotida.

8. Runs

Runs mirip dengan repeat, tetapi pada run pengulangannya hanya 1 jenis basa. Runs juga harus dihindari karena dapat menyebabkan mispriming. Contohnya: TCAGGGGGTAGCGGGGTA memiliki run basa G 5 dan 4. Jumlah maksimum run yang dapat diterima adalah 4 basa.

9. Stabilitas ujung 3′

Ini adalah nilai ΔG maksimum dari 5 basa terakhir ujung 3′. Ujung 3′ yang lebih tidak stabil (nilai ΔG lebih negatif) akan mengurangi kemungkinan terjadinya false priming.

10. Hindari struktur sekunder DNA template.

Struktur sekunder dapat terjadi ketika DNA berada dalam utas tunggal (yang sangat tidak stabil), dengan melipat membentuk konformasi tertentu. Stabilitas struktur sekunder template ini sangat bergantung pada energi bebas dan suhu leleh (Tm). Adanya struktur sekunder menyebabkan primer tidak dapat menempel pada template karena struktur sekunder ini cukup stabil bahkan saat suhunya di atas temperatur annealing (Ta), akibatnya yield produk PCR akan sangat berkurang. Untuk itu hindari mendesain primer pada posisi dimana terbentuknya struktur sekunder yang stabil, terutama jika primer akan digunakan untuk qPCR.

11. Hati-hati dengan Cross Homologi

Hindari mendesain primer pada daerah homologi. Primer yang dirancang tidak boleh mengamplifikasi gen atau daerah lain yang homolog dengan gen target kita. Jika itu terjadi maka produk PCR tidaklah spesifik dan bisa lebih dari satu produk. Kita bisa menggunakan BLAST di situs NCBI untuk memeriksa apakah primer kita bisa menempel di tempat lain.

Parameter untuk Pasangan Primer

Selain parameter untuk masing-masing primer, perlu diperhatikan juga parameter untuk pasangan primer. Karena bisa saja kedua primer yang kita rancang berkualitas baik namun ketika dipasangkan mereka tidak cocok.

1. Panjang amplikon

Panjang amplikon alias produk PCR ditentukan oleh tujuan eksperimen itu sendiri. Pada qPCR panjang target biasanya sekitar 100 bp dan untuk standar PCR sekitar 500 bp. Jika kita tahu posisi primer pada template, maka:

Panjang produk = (Posisis primer antisense - posisi primer sense) + 1

2. Posisi produk

Primer bisa kita tempatkan dekat dengan ujung 5′, dekat ujung 3′ atau di posisi manapun yang kita mau. Namun umumnya sekuen yang dekat dengan ujung 3′ diketahui memiliki tingkat kepercayaan yang lebih tinggi.

3. Tm Produk

Mirip dengan Tm primer, Tm antara primer dan template juga bisa menyatakan tingkat kestabilan duplex primer-template.

4. Temperatur annealing Optimum (Ta Opt)

Ta yang optimum akan sangat menunjang kualitas reaksi PCR. Untuk menghitungnya bisa digunakan rumus Rychlik:

Ta Opt = 0.3 x(Tm primer) + 0.7 x(Tm produk) - 25

Dimana:

Tm primer = suhu leleh (Tm) primer-template yang lebih tidak stabil.

Tm produk = suhu leleh (Tm) produk PCR.

5. Selisih Tm pasangan primer

Sepasang primer harus memiliki Tm yang nilainya berdekatan. Jika selisihnya lebih dari 5 °C maka bisa menyebabkan tidak terjadinya amplifikasi.

Anda punya pengalaman mendesain primer yang ingin dibagikan dengan yang lain? Silakan ungkapkan di kolom comments di bawah ini.

References:

• http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html

Other articles you may like:

• 6 Faktor Penting dalam Reverse Transcriptase PCR
• Menambahkan Ekor “A” pada Produk PCR Blunt
• Troubleshooting Guide. ‘Keanehan-keanehan’ pada Electropherogram
• Struktur Molekul Protein
• Replikasi DNA
• Tanya Jawab Seputar Analisa DNA Sequencing
• Menguji Spesifisitas Primer

Tags: BioInformatics oligonucleotide PCR primer primer design