Dalam tulisan terdahulu yang berjudul Troubleshooting Guide. ‘Keanehan-keanehan’ pada Electropherogram, kita bisa tahu bahwa tidak selamanya hasil pembacaan alat DNA sequencer kualitasnya baik. Nah, jika kebetulan electropherogram sampel kita jelek, jangan dulu frustasi, mungkin masih ada jalan keluar untuk meningkatkan kualitas electropherogram sehingga dapat terbaca dengan baik. Memang tidak semua electropherogram yang jelek bisa diselamatkan, jika kualitasnya sangat parah tentu jangan berharap bisa ‘disulap’ menjadi bagus. Tapi jika kualitas awalnya cukup bagus, bolehlah berharap kekurangannya dapat diperbaiki.

Software Basecaller

Kualitas electropherogram dapat ditingkatkan dengan menggunakan perangkat lunak (software) basecaller, software ini berfungsi untuk menterjemahkan data mentah (raw data) pembacaan laser pada mesin sequencer menjadi peak-peak electropherogram yang dapat dibaca komputer dan manusia (trace file). Selama ini pun setiap komputer mesin sequencer pasti memiliki software basecaller ini, namun kemampuan mereka masih ’standar’ dan masih ada celah untuk ditingkatkan lagi. Beberapa software basecaller yang sangat terkenal yaitu Phred, TraceTuner, KB Basecaller dan PeakTrace. Semuanya dapat memproses data electropherogram yang dihasilkan oleh mesin sequencer bermerk ABI (Applied Biosystems, USA) berbagai tipe.

Pemrosesan Trace File vs Raw Data

Bagaimana software-software basecaller itu bekerja? Mari kita selidiki:

• Phred dan TraceTuner bekerja dengan melakukan re-basecalling data peak yang sudah diproses dalam trace file (bukan raw data), sehingga akurasi basecalling mereka sangat bergantung pada kualitas peak yang dihasilkan oleh ABI data collection software.
• KB Basecaller adalah software basecaller yang terintegrasi pada beberapa “Data Collection Software” bawaan mesin sequencing ABI generasi baru seperti seri 3100 dan 330/xl. Raw data diproses oleh KB Basecaller hingga menghasilkan trace file lengkap dengan Quality Value (QV) dari peak-peaknya.
• PeakTrace —seperti halnya KB Basecaller— bekerja dengan memproses kembali langsung dari raw datanya, namun dengan kelebihan yaitu mampu membaca raw data mesin generasi lama seperti ABI seri 3700 dan 377, yang sudah tidak didukung lagi oleh KB Basecaller. Dengan prinsip kerja seperti ini, PeakTrace bisa memberikan basecall yang lebih baik secara signifikan dengan error lebih sedikit dan pembacaan yang lebih panjang.

Dari keempat software di atas, kita akan membahas PeakTrace saja, selain tersedianya versi gratis, software ini pun diklaim memberikan output yang lebih baik.

PeakTrace

Peak trace dapat diakses langsung dari websitenya (www.nucleics.com) secara free alias gratis, tapi dibatasi maksimum 10 file yang dapat di-trace per hari. Jika jumlah file Anda sangat banyak dan rutin, Anda bisa menggunakan versi berbayar. PeakTrace dapat menangani electropherogram dari berbagai jenis mesin ABI baik keluaran baru atau lama, dan mesin sequencer MegaBACE.

Langsung Praktek

Untuk men-trace electropherogram menggunakan layanan PeakTrace gratis online, ikutilah langkah-langkah berikut, sangat simple:

• Buka halaman PeakTrace service online.

• Klik tombol ‘Choose…‘ untuk mencari file electropherogram yang akan Anda trace (format *.ab1 atau *.abi). Anda dapat mengunggah (upload) 1 atau 2 file sekaligus.
• Tekan tombol ‘Upload Traces‘.
• Tunggulah sekitar 5-20 detik (waktu tunggu bergantung pada jumlah dan jenis trace dan juga load server saat itu).
• Klik link ‘Go to the PeakTrace basecalling results page now’.

• Hasil trace siap untuk diunduh (download) dengan mengklik link file output (sama dengan nama file yang anda submit).

Berikut ini adalah contoh tracing yang berhasil menggunakan PeakTrace. Nilai Q20+ meningkat sebesar 169 poin (32.50%). Bandingkan antara peak-peak sebelum (atas) dan setelah di-PeakTrace (bawah), terasa sangat membantu bukan?

Selalu berhasilkah?

Seperti telah disinggung di awal tulisan, tidak semua electropherogram dapat ditingkatkan kualitasnya menggunakan PeakTrace maupun software basecaller lainnya. Faktor utama yang membuat peak tidak dapat diperbaiki adalah:

• Panjang pembacaan. Untuk sampel DNA yang pendek, dimana pembacaan oleh KB Basecaller sudah sempurna maka kualitasnya tidak dapat ditingkatkan lagi oleh PeakTrace. Jadi kalau electropherogram Anda sudah bagus tidak perlulah ditrace lagi, hanya membuang waktu dan energi. Kemampuan PeakTrace akan lebih terasa pada sampel DNA yang cukup panjang dimana biasanya resolusi peak electropherogram pada bagian belakang (mendekati ujung 3′) sudah berkurang.
• Kekuatan signal raw data. Jika signal sangat lemah (mendekati level signal noise) maka PeakTrace tidak akan mampu berbuat apa-apa lagi. Kekuatan signal sangat penting terutama pada bagian ujung 3′. Ingat bahwa tugas PeakTrace adalah meningkatkan kualitas peak yang sudah cukup bagus, bukan membuat peak yang jelek jadi bagus.
• Kegagalan reaksi sequencing. Sudah pasti, PeakTrace dan software basecaller lainnya bukanlah pesulap yang dapat membuat suatu reaksi sequencing yang tidak terjadi menjadi seolah-olah berhasil. Signal yang bercampur akibat adanya dua template atau lebih. Kalau sudah begini, meskipun software basecaller mampu men-trace-nya, tetapi hasilnya tetap saja tidak berguna dan tidak memberikan hasil apa-apa.

Sekuen pendek dengan pembacaan yang sudah bagus oleh software sequence collection	Kualitas electropherogram dengan signal yang lemah tidak dapat ditingkatkan lagi	PeakTrace tidak dapat menyulap reaksi yang gagal menjadi tiba-tiba berhasil

Bagaimana? Anda pun bisa langsung mencobanya sekarang dan membagi pengalaman Anda dengan pengunjung lainnya di kolom komentar di bawah.

Similar Posts:

• Interpretasi Electropherogram DNA Sequencing
• Sequence Alignment di BioEdit
• Faktor Penentu Keberhasilan Analisa DNA sequencing
• Troubleshooting Guide. ‘Keanehan-keanehan’ pada Electropherogram
• Mengenal Teknik DNA Sequencing