PeakTrace; Meningkatkan Kualitas Electropherogram
Perbedaan hasil basecaller antara ABI KB dan PeakTrace (image from nucleics.com)
Dalam tulisan terdahulu yang berjudul Troubleshooting Guide. ‘Keanehan-keanehan’ pada Electropherogram, kita bisa tahu bahwa tidak selamanya hasil pembacaan alat DNA sequencer kualitasnya baik. Nah, jika kebetulan electropherogram sampel kita jelek, jangan dulu frustasi, mungkin masih ada jalan keluar untuk meningkatkan kualitas electropherogram sehingga dapat terbaca dengan baik. Memang tidak semua electropherogram yang jelek bisa diselamatkan, jika kualitasnya sangat parah tentu jangan berharap bisa ‘disulap’ menjadi bagus. Tapi jika kualitas awalnya cukup bagus, bolehlah berharap kekurangannya dapat diperbaiki.
Software Basecaller
Kualitas electropherogram dapat ditingkatkan dengan menggunakan perangkat lunak (software) basecaller, software ini berfungsi untuk menterjemahkan data mentah (raw data) pembacaan laser pada mesin sequencer menjadi peak-peak electropherogram yang dapat dibaca komputer dan manusia (trace file). Selama ini pun setiap komputer mesin sequencer pasti memiliki software basecaller ini, namun kemampuan mereka masih ‘standar’ dan masih ada celah untuk ditingkatkan lagi. Beberapa software basecaller yang sangat terkenal yaitu Phred, TraceTuner, KB Basecaller dan PeakTrace. Semuanya dapat memproses data electropherogram yang dihasilkan oleh mesin sequencer bermerk ABI (Applied Biosystems, USA) berbagai tipe.
Pemrosesan Trace File vs Raw Data
Bagaimana software-software basecaller itu bekerja? Mari kita selidiki:
- Phred dan TraceTuner bekerja dengan melakukan re-basecalling data peak yang sudah diproses dalam trace file (bukan raw data), sehingga akurasi basecalling mereka sangat bergantung pada kualitas peak yang dihasilkan oleh ABI data collection software.
- KB Basecaller adalah software basecaller yang terintegrasi pada beberapa “Data Collection Software” bawaan mesin sequencing ABI generasi baru seperti seri 3100 dan 330/xl. Raw data diproses oleh KB Basecaller hingga menghasilkan trace file lengkap dengan Quality Value (QV) dari peak-peaknya.
- PeakTrace —seperti halnya KB Basecaller— bekerja dengan memproses kembali langsung dari raw datanya, namun dengan kelebihan yaitu mampu membaca raw data mesin generasi lama seperti ABI seri 3700 dan 377, yang sudah tidak didukung lagi oleh KB Basecaller. Dengan prinsip kerja seperti ini, PeakTrace bisa memberikan basecall yang lebih baik secara signifikan dengan error lebih sedikit dan pembacaan yang lebih panjang.
Dari keempat software di atas, kita akan membahas PeakTrace saja, selain tersedianya versi gratis, software ini pun diklaim memberikan output yang lebih baik.
PeakTrace
Peak trace dapat diakses langsung dari websitenya (www.nucleics.com) secara free alias gratis, tapi dibatasi maksimum 10 file yang dapat di-trace per hari. Jika jumlah file Anda sangat banyak dan rutin, Anda bisa menggunakan versi berbayar. PeakTrace dapat menangani electropherogram dari berbagai jenis mesin ABI baik keluaran baru atau lama, dan mesin sequencer MegaBACE.
Langsung Praktek
Untuk men-trace electropherogram menggunakan layanan PeakTrace gratis online, ikutilah langkah-langkah berikut, sangat simple:
- Buka halaman PeakTrace service online.
- Klik tombol ‘Choose…‘ untuk mencari file electropherogram yang akan Anda trace (format *.ab1 atau *.abi). Anda dapat mengunggah (upload) 1 atau 2 file sekaligus.
- Tekan tombol ‘Upload Traces‘.
- Tunggulah sekitar 5-20 detik (waktu tunggu bergantung pada jumlah dan jenis trace dan juga load server saat itu).
- Klik link ‘Go to the PeakTrace basecalling results page now’.
- Hasil trace siap untuk diunduh (download) dengan mengklik link file output (sama dengan nama file yang anda submit).
Berikut ini adalah contoh tracing yang berhasil menggunakan PeakTrace. Nilai Q20+ meningkat sebesar 169 poin (32.50%). Bandingkan antara peak-peak sebelum (atas) dan setelah di-PeakTrace (bawah), terasa sangat membantu bukan?
Selalu berhasilkah?
Seperti telah disinggung di awal tulisan, tidak semua electropherogram dapat ditingkatkan kualitasnya menggunakan PeakTrace maupun software basecaller lainnya. Faktor utama yang membuat peak tidak dapat diperbaiki adalah:
- Panjang pembacaan. Untuk sampel DNA yang pendek, dimana pembacaan oleh KB Basecaller sudah sempurna maka kualitasnya tidak dapat ditingkatkan lagi oleh PeakTrace. Jadi kalau electropherogram Anda sudah bagus tidak perlulah ditrace lagi, hanya membuang waktu dan energi. Kemampuan PeakTrace akan lebih terasa pada sampel DNA yang cukup panjang dimana biasanya resolusi peak electropherogram pada bagian belakang (mendekati ujung 3′) sudah berkurang.
- Kekuatan signal raw data. Jika signal sangat lemah (mendekati level signal noise) maka PeakTrace tidak akan mampu berbuat apa-apa lagi. Kekuatan signal sangat penting terutama pada bagian ujung 3′. Ingat bahwa tugas PeakTrace adalah meningkatkan kualitas peak yang sudah cukup bagus, bukan membuat peak yang jelek jadi bagus.
- Kegagalan reaksi sequencing. Sudah pasti, PeakTrace dan software basecaller lainnya bukanlah pesulap yang dapat membuat suatu reaksi sequencing yang tidak terjadi menjadi seolah-olah berhasil. Signal yang bercampur akibat adanya dua template atau lebih. Kalau sudah begini, meskipun software basecaller mampu men-trace-nya, tetapi hasilnya tetap saja tidak berguna dan tidak memberikan hasil apa-apa.
 |
 |
 |
Sekuen pendek dengan pembacaan yang sudah bagus oleh software sequence collection |
Kualitas electropherogram dengan signal yang lemah tidak dapat ditingkatkan lagi |
PeakTrace tidak dapat menyulap reaksi yang gagal menjadi tiba-tiba berhasil |
Bagaimana? Anda pun bisa langsung mencobanya sekarang dan membagi pengalaman Anda dengan pengunjung lainnya di kolom komentar di bawah.
Other articles you may like:
- Interpretasi Electropherogram DNA Sequencing
- DROPBOX; Simpan-Ambil-Bagi File Kapanpun Dimanapun
- Sequence Alignment di BioEdit
- Faktor Penentu Keberhasilan Analisa DNA sequencing
- Troubleshooting Guide. ‘Keanehan-keanehan’ pada Electropherogram
- Membuat Pohon Filogenetik
- Memetakan Situs Enzim Restriksi
![Bakteri purba dari sedimen sub-permukaan [image from: the-scientist.com]](http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2012/05/20120523-074119-60x33.jpg "Bakteri purba dari sedimen sub-permukaan [image from: the-scientist.com]"){kind=small}
8 Comments
Pak Yepy saya ingin sedikit bertanya…saya mengerjakan proyek untuk identifikasi SNP melalui direct sequencing ini dan ada kalanya hasil sequencingnya agak jelek (terutama di bagian SNPnya tersebut)
Apakah dengan menggunakan program ini, kemungkinan hasil perbaikannya justru malah akan bisa menghilangkan SNP tersebut?
Sebagai contoh: misalkan hasil sequencing menunjukkan adanya 2 peak (C/T) yg dibaca sebagai N, lalu setelah di perbaiki akan dibaca sebagai C (dimana peak yg C akan ditingkatkan sedangkan yg T diturunkan)
Thx ^^
Halo Rinaldy,
Setau saya, program ini membaca kembali raw data dari electropherogram, untuk memudian di-basecalling kembali dengan algoritma tertentu yang dia miliki. Jadi program ini tidak akan mengubah raw data (hasil pembacaan alat) original, hanya hasil basecalling-nya saja yang lebih tajam/lebih baik.
Untuk sequencing bagian yang mengandung SNP, jika memang di situ terdapat 2 peak, maka akan tetap terbaca sebagai 2 peak, hanya mungkin bentuknya akan lebih sharp/jelas, tidak akan menghilangkan salah satu. Jika ada bagian sequence yang kurang bagus karena sample-nya bermasalah, maka program ini tidak dapat membantu memperbaiki, jadi sifatnya hanya menyempurnakan hasil yang sudah baik/cukup baik.
Mudah-mudahan bisa membantu ^_^
siipp deh : )
Pak Yepy, saya ingin bertanya. Kemarin saya mengirimkan sampel hasil PCR untuk disequencing. Berdasarkan hasil elektroforesis, ukuran pita yang terbentuk berada di atas 200 bp (220 bp). Akan tetapi, entah mengapa di hasil sekuensing yang diberikan menunjukka ukuran sekuens terkecil adalah 190 bp. Kira-kira apa yang menyebabkan hal ini bisa terjadi dan apakah ada penyelesaiannya juga Pak Yepy?
Terima kasih
halo Ritchie, yang dimaksud 190 bp itu hasil dari 1 reaksi sekuensing ya? Jika iya, memang begitu adanya. Salah satu kelemahan DNA sequencing metode dye terminator seperti yang sekarang ini umum digunakan, yaitu bagian penempelan primer (sekitar 20 bp) dan 10-20 bp setelah itu tidak terbaca oleh alat, jadi kita akan kehilangan sekitar 30-40 bp sekuen awal. Jadi kalau ukuran DNA-nya 220 bp, yang terbaca ya sekitar 190 bp itu. Untuk mengatasinya, biasanya sekuensing dilakukan dengan 2 arah primer, forward dan reverse, sehingga bagian yang tidak terbaca oleh satu primer akan terbaca dengan primer pasangannya.
Demikian semoga membantu.
Terima kasih Pak Yepy ^^
gimana cara buat power point tentang bab bioteknologi yang hasil nya memuaskan?
Sama seperti teknik pembuatan presentasi powerpoint pada umumnya, buat kerangka materi yang jelas, padat dan efektif. Kemudian buat tampilan yang menarik tetapi tidak berlebihan, yang penting presentasinya nyaman dilihat ketika disajikan. Kemudian tambahkan ilustrasi foto atau video yang relevan dan menarik, animasi juga bisa membantu tetapi juga jangan berlebihan. Komposisi antara teks, gambar/video dan ruang kosong pada presentasi juga harus diperhatikan. Lalu jangan lupa minta pendapat rekan atau calon audiens mengenai kualitas presentasi yang kita buat.