Review: Faktor-faktor yang Mempengaruhi Ekspresi Protein Heterologus di dalam E. coli

Di antara berbagai mikroorganisme yang dapat digunakan untuk memproduksi protein heterologus, E. coli menjadi salah satu pilihan yang paling menarik. Berbagai keunggulan yang dimiliki E. coli antara lain adalah kemampuannya untuk tumbuh dengan cepat, densitas sel yang tinggi, substrat pertumbuhan yang murah, karakteristik genetik yang jelas, serta ketersediaan berbagai pasangan vektor kloning dan strain mutan. Meskipun tidak selalu ada jaminan bahwa protein heterologus akan dihasilkan oleh E. coli dalam jumlah yang tinggi dan aktif secara biologis, berbagai cara telah dilakukan untuk meningkatkan performa dari mikroorganisme ini. Berikut ini adalah sedikit penjelasan mengenai faktor-faktor yang selama ini dikaji berbagai peneliti untuk meningkatkan performa E. coli sebagai inang ekspresi protein heterologus:

Jumlah copy dari plasmid dan maintenance nya

Untuk menghasilkan protein dalam jumlah yang tinggi, cDNA heterologus terlebih dahulu dikloning ke dalam plasmid yang akan terus-menerus direplikasi dan biasanya berjumlah 15-60 hingga beberapa ratus copy per sel. Pada kondisi percobaan di lab, plasmid multicopy ini didistribusikan secara acak selama pembelahan sel, dan bila tidak ada agen penyeleksinya, plasmid ini bisa hilang meskipun jumlahnya hanya sedikit. Selain itu plasmid high copy number juga bisa hilang apabila produk gen yang dihasilkan bersifat toksik bagi mikroba, atau mengurangi laju pertumbuhan, atau pada proses produksi yang continuous.

Cara yang paling mudah untuk mempertahankan keberadaan plasmid di dalam sel bakteri adalah dengan menerapkan agen penyeleksi yang umumnya berupa antibiotik. Dengan adanya antibiotik maka sel yang tidak mengandung plasmid yang memiliki resistensi terhadap antibiotik tersebut akan mati. Sedangkan kelemahan dari cara ini adalah kemungkinan menurunnya aktivitas antibiotik akibat degradasi maupun inaktivasi oleh enzim-enzim detoksifikasi (seperti β-lactamase) yang dihasilkan mikroba. Kelemahan yang lain adalah adanya kemungkinan kontaminasi antibiotik pada produk protein yang dihasilkan.

Promotor

Sudah sejak lama operon lac pada E. coli dikenal dalam sistem regulasi ekspresi pada prokariot. Oleh karena itu tidak mengherankan apabila banyak promotor untuk transkripsi gen dikonstruksi dari operon lac. Namun demikian promotor lac bukanlah promotor yang cukup kuat dan jarang digunakan untuk ekspresi protein heterologus dalam jumlah tinggi. Selain itu kelemahan lain dari promotor lac ini adalah membutuhkan agen penginduksi berupa IPTG yang harganya tidaklah murah. Namun, hal ini tidak terlalu menjadi masalah apabila produk protein yang dihasilkan nantinya memiliki nilai ekonomis yang tinggi. Selain itu sebenarnya IPTG dengan konsentrasi 50-100 µM sudah cukup untuk digunakan sebagai penginduksi. Selain IPTG, laktosa juga dapat digunakan sebagai agen penginduksi.

Selain promotor lac, promotor lain yang umum digunakan adalah T7. Dengan adanya induksi oleh T7 RNA polymerase, sintesis mRNA dalam jumlah yang tinggi akan terjadi. Dan pada sebagian besar penelitian, akumulasi protein heterologus dalam jumlah tinggi berhasil diperoleh pula. Namun, kelemahan yang dapat terjadi adalah konsentrasi mRNA yang tinggi juga dapat mengakibatkan kerusakan ribosom dan kematian sel. Kelemahan lain dari T7 dan promotor kuat lainnya adalah protein yang dihasilkan sering tidak mampu membentuk konformasi sesuai seharusnya dan bisa saja sebagian atau bahkan seluruhnya tersegregasi membentuk inclusion body. Ada beberapa cara untuk menyiasati terbentuknya inclusion body ini dan salah satu alternatif yang bisa digunakan terkait dengan promotor adalah menggunakan promotor yang terinduksi pada suhu rendah. Hal ini disebabkan umumnya pelipatan protein lebih bagus pada suhu rendah. Bahkan saat ini telah ada berbagai review yang membahas tentang berbagai promotor yang diregulasi oleh bermacam-macam sinyal seperti pH, konsentrasi O2 terlarut, osmolaritas, dsb.

Elemen-elemen upstream

Sekuen DNA yang terletak sebelum promotor juga memainkan peranan yang penting dalam efisiensi transkripsi. Daerah “upstream” yang terletak sekitar 35 nukleotida sebelum titik awal transkripsi ini memiliki sekuen yang mengandung banyak basa Adenine dan Thymine yang dapat meningkatkan transkripsi dengan cara berinteraksi dengan sub unit α dari RNA polymerase.

Kestabilan mRNA

mRNA dari E. coli cenderung tidak stabil, dengan waktu paruh mulai dari 30 detik – 20 menit. Enzim-enzim yang terkait dengan degradasi mRNA adalah eksonuclease 3’→ 5’ dan endonuclease RNAse E.

Masalah-masalah terkait translasi

Inisiasi translasi mRNA dari E. coli membutuhkan sekuen Shine Dalgarno yang komplementer dengan ujung 3’ dari 16S rRNA dan dari konsensus 5’-UAAGGAGG-3’; kemudian diikuti oleh kodon inisisasi yang hampir selalu berupa AUG.

Selain itu penggunaan kodon yang berbeda antara prokariot dan eukariot juga dapat memberikan efek yang cukup berarti dalam proses produksi protein. Kodon Arginin AGA dan AGG jarang ditemukan pada E. coli, tetapi umum pada Saccharomyces cerevisiae dan golongan eukariot lain. Keberadaan kodon-kodon yang tidak umum pada gen yang diklon dapat mempengaruhi tingkat akumulasi protein, kestabilan plasmid dan mRNA, dan pada kondisi ekstrim dapat menghambat sintesis protein dan pertumbuhan sel.

Pelipatan di sitoplasma

Produksi protein heterologus secara berlebihan di dalam sitoplasma E. coli sering disertai dengan kesalahan pelipatan dan segregasi menjadi agregat tidak larut yang dikenal sebagai inclusion body. Meskipun pembentukan inclusion body dapat memudahkan proses purifikasi protein, tetapi tidak ada jaminan bahwa proses pelipatan ulang secara in vitro akan menghasilkan produk yang aktif secara biologis. Salah satu cara menyiasati terbentuknya agregat protein ini adalah dengan merekayasa proses fermentasi yang umumnya dengan cara mengurangi suhu selama proses fermentasi.

Berdasarkan temuan-temuan terbaru, proses pelipatan protein secara in vivo dibantu oleh berbagai molekul lain yang kita kenal sebagai chaperones. Fungsi dari chaperone adalah membantu proses isomerisasi dengan tepat dan dalam proses protein targeting. Dengan memahami berbagai fungsi dari chaperone ini maka pembentukan inclusion body dapat dikurangi.

Degradasi sitoplasmik

Degradasi protein di dalam sitoplasma merupakan salah satu contoh proses katabolisme. Proses ini adalah suatu cara yang efisien bagi sel untuk menyelamatkan sumber-sumber daya yang dimilikinya dengan cara mendaur ulang protein-protein yang salah melipat atau sudah rusak menjadi asam-asam amino penyusunnya kembali. Di dalam sitoplasma E. coli, proses awal daur ulang ini telah diketahui setidak-tidaknya dilakukan oleh 5 heat shock protein yang membutuhkan ATP untuk kinerjanya.

Salah satu cara untuk mencegah proses degradasi adalah menggunakan inang E. coli yang mempunyai mutasi pada gen-gen proteasenya. Namun, hal ini tentunya bukan tanpa kelemahan pula. Mutasi pada gen-gen protease tersebut sebagai contohnya dapat mengakibatkan bakteri menjadi berfilamen, serta mengurangi laju pertumbuhan dan kebugaran sel.

Protein-protein fusi

Meskipun protein-protein fusi sebenarnya dikonstruksi untuk memfasilitasi purifikasi protein dan imobilisasi, serta untuk membantu aktivitas enzim-enzim tertentu, ternyata diketahui pula bahwa beberapa protein fusi dapat meningkatkan kelarutan protein target sehingga mengurangi pembentukan inclusion body. Alasan yang paling mungkin untuk menjelaskan hal ini adalah: seketika setelah dikeluarkan dari ribosom, protein fusi dapat membentuk konformasi dirinya sendiri secara efisien dan cepat, kemudian segera membantu proses pelipatan protein target dengan cara meningkatkan proses isomerisasi.

Meskipun demikian, kelemahan utama dari penggunaan teknologi protein fusi adalah: proses pembebasan protein target membutuhkan protease yang mahal, proses pembebasan ini pun sering tidak berlangsung sempurna sehingga yield yang diperoleh kecil; memerlukan langkah-langkah tambahan untuk mendapatkan produk yang aktif secara biologis (misalnya pembentukan dan isomerisasi ikatan-ikatan disulfida); dan kelarutannya sendiri tidak selalu terjamin.

Sekresi

Berbagai polipeptida yang ditujukan untuk dikeluarkan dari sel disintesis terlebih dahulu sebagai pra-protein yang memiliki sekuen sinyal di ujung aminonya yang nantinya akan dipotong selama proses translokasi oleh peptidase-peptidase yang ada di membran sebelah dalam. Umumnya sekuen peptida sinyal ini memiliki panjang 18-30 asam amino dan terdiri dari dua atau lebih residu basa pada ujung aminonya, sekuen inti yang bersifat hidrofobik sekitar 7 asam amino, serta ujung karboksil hidrofilik yang akan dikenali oleh peptidase. Penggunaan berbagai sinyal sekuen ini dalam penelitian di lab telah banyak membantu translokasi peptida-peptida heterologus secara efektif. Tetapi dalam beberapa kasus, tetap saja pra-protein yang terbentuk tidak dapat dikeluarkan dari sel dan justru terjadi penumpukan di membran dalam, membentuk inclusion body, atau bahkan malah didegradasi di dalam sitoplasma.

Agar proses translokasi berjalan efisien pra-protein harus dibawa ke daerah membran sebelah dalam dalam keadaan terelaksasi. Kondisi relaksasi ini dipertahankan oleh molekul-molekul chaperone yang ada di dalam sel. Dengan memahami proses sekresi protein dari dalam sel maka setidaknya ada 3 hipotesis yang dapat diajukan terhadap permasalahan terkait sekresi proein ini, yaitu: kesalahan pelipatan dan degradasi beberapa protein heterologus disebabkan translokasi yang tidak baik karena chaperone yang mungkin tidak bekerja secara efisien; atau karena protein target melipat dirinya terlalu dini sehingga bentuknya sudah terlalu kaku; atau karena jumlah chaperone yang terbatas sehingga tidak sebanding dengan pra-protein yang diproduksi dalam jumlah besar.

Pelipatan dan degradasi di dalam periplasma

Daerah periplasma merupakan lingkungan yang bersifat oksidatif dan memiliki enzim-enzim untuk mengakatalisis pembentukan dan penyusunan kembali ikatan-ikatan disulfida. Sehingga daerah inilah yang menjadi salah satu daerah yang harus dilewati agar protein yang disekskresikan dapat terlipat dengan sempurna. Beberapa studi menunjukkan bahwa produksi enzim isomerase ikatan disulfida yang berlebihan nantinya akan dapat membantu meningkatkan pembentukan ikatan disulfida pada protein heterologus yang mengadung banyak Cysteine (contoh: aktivator plasminogen jaringan dari manusia). Pada daerah periplasma ini juga terdapat beberapa enzim proteolitik yang terlibat dalam proses degradasi protein. Berbagai galur E. coli yang memiliki mutasi pada gen-gen protease telah dikembangkan dan terbukti dapat mengurangi permasalahan akibat degradasi protein heterologus yang dihasilkan. Namun, kekurangannya tentu saja pada laju pertumbuhan bakteri yang melambat. Selain itu, rekayasa juga dapat dilakukan pada permeabilitas membran luar bakteri sehingga protein-protein katalis yang tadinya ada di daerah periplasma dapat keluar juga ke medium pertumbuhan sel. Hal ini nantinya dapat membantu untuk proses purifikasi protein target.

Kesimpulan

Perkembangan pemahaman mengenai fungsi, regulasi, dan interaksi produk-produk selular, bersama dengan ketersediaan berbagai alat-alat dalam ilmu genetika menjadikan E. coli sebagai inang yang paling menarik untuk produksi protein-protein heterologus. Berbagai fakta bahwa masih sedikit informasi yang diungkapkan untuk tujuan praktikal dan masih banyak aspek fundamental terkait fisiologi E. coli yang belum terungkap akan semakin mendorong keinginan untuk mengoptimalkan mikroorganisme ini sebagai sarana ekspresi protein heterologus. Penemuan-penemuan terbaru untuk meningkatkan performa kerja E. coli tampaknya masih akan terus terjadi. Meskipun modifikasi pasca translasi (seperti glikosilasi) masih merupakan hal yang tampaknya mustahil bagi E. coli, berbagai strain baru yang bermanfaat dalam proses produksi berbagai protein eukariot heterologus secara ekonomis diharapkan akan segera tersedia di masa mendatang.

Sumber: Baneyx F. 1999. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current opinion in Biotechnology 10: 411-421.

Other articles you may like:

• Bakteri Penghasil Plastik
• GFP dalam Studi Ekspresi Gen
• Tips & Trik untuk SDS PAGE
• Proses Perbaikan DNA yang Rusak: Mencari Jarum dalam Tumpukan Jerami
• Struktur Molekul Protein
• “Reaper” Protein; Mimpi Buruk Sel.
• 6 Faktor Penting dalam Reverse Transcriptase PCR

Tags: antibiotik cloning e coli ekspresi protein expression heterologous plasmid protein protein expression