Saat kita melakukan sequencing pake metode dye-terminator (yang saat ini umum digunakan), sekuen primer yang kita gunakan pada reaksi cycle sequencing tidak akan terbaca oleh alat, karena primer yang digunakan tidak dilabel fluorescent, otomatis tidak akan terbaca oleh detektor lasernya.

Tapi jangan khawatir, primer yang kita gunakan justru akan terbaca pada pembacaan dari arah sebaliknya. Jadi kalo primer Forward akan terbaca dari reaksi Reverse, dan sebaliknya, primer Reverse akan terbaca dari reaksi Forward. Tepatnya sekuen pada ujung 3′ (paling terakhir muncul) adalah sekuen dari primer arah sebaliknya itu.

Contoh nih, kita mensekuen dengan primer Forward, hasil pembacaan alat misalnya kayak gini (saya tampilkan ujung 3′-nya aja):

……tgatagatagaACGTGTCGTAGTG

Maka sekuen primer arah sebaliknya (reverse) adalah yang tercetak dengan huruf kapital. Tapi ingat, karena posisinya terbalik, maka sekuen tersebut harus di-reverse-complement-kan. Jadi sekuen Primer Reversenya adalah:

CACTACGACACGT

Begitu juga sebaliknya.

Perlu diingat juga, sekuen primer kita akan terbaca oleh alat jika produk PCR yang kita analisa tidak terlalu panjang, jadi masih dalam batas kemampuan alat sekuensernya. Soalnya setiap mesin sekuenser memiliki kemampuan panjang pembacaan yang berbeda-beda. So.. kalo produk PCR kita lebih dari 1 kb misalnya, sepertinya gak mungkin kita bisa dapetin sekuen primer.

Cara lainnya adalah dengan melakukan analisa BLAST dari hasil sekuen, tapi ini sifatnya perkiraan saja. Jadi jika primer yang kita gunakan adalah primer yang spesifik untuk gen tertentu atau daerah-daerah sekuen tertentu yang sudah diketahui, maka jika hasil BLAST menunjukkan identitas yang kita harapkan (sesuai dengan fungsi primernya), berarti bisa diduga kuat bahwa primer kita sudah bekerja dengan baik mengamplifikasi daerah yang dimaksud.

Pembacaan Sekuen Conserve
Pada artikel di atas, yang mbak maksud sekuen conserve mungkin yang saya tulis sebagai “Consensus” itu. Jadi, dari hasil pembacaan sekuen dari kedua arah, dilakukan pairwise alignment, dan setelah disejajarkan dibuatlah sekuen yang merupakan gabungan keduanya (consensus).

Terkadang ada ketidakcocokan hasil pembacaan dari suatu arah dengan arah sebaliknya, misalnya dari arah forward terbaca “C” sementara sebaliknya terbaca “A”. Ini bisa saja terjadi terutama jika terjadi error pembacaan karena satu dan lain hal. Nah kalo terjadi yang seperti ini maka kita harus merujuk kembali ke kedua electropherogramnya, pada posisi tersebut peak mana yang benar-benar peak, apakah C atau A, lalu kemudian ditentukan mana yang kita ambil.

OK mbak? semoga bisa membantu…