Archive for: buffer

TE Buffer vs ddH2O

Mana yang lebih baik untuk melarutkan DNA/RNA? TE Buffer atau ddH2O? Pertanyaan ini seringkali muncul dan menjadi bahan diskusi yang menarik. Dan ternyata masing-masing memiliki kelebihan dan kelemahan sehingga pelarut mana yang dipilih amat bergantung pada tujuan kita melarutkan DNA/RNA.

TE Buffer

TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. Berikut ini resep pembuatannya:

Larutan Tris-HCl 1 M pH 7.5
Untuk membuat 1 L larutan:

• Tambahkan 121.14 g Tris Base (BM = 121.14 g/mol) ke dalam 800 mL ddH2O
• Atur pH hingga mencapai pH 8.0 dengan larutan HCl 4N
• Tambahkan ddH2O hingga volumenya tepat 1 L

Catatan: Nama kimia dan nama lain dari Tris base adalah 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol, THAM, Tris(hydroxymethyl)aminomethane, atau Trometamol

Larutan EDTA 500 mM pH 8.0
Untuk membuat 1 L larutan:

• Tambahkan 186,12 g Sodium EDTA dihydrate (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) atau 146.12 g EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) ke dalam 800 mL ddH2O
• Atur pH hingga mencapai pH 8.0 dengan larutan NaOH 4 N
• Tambahkan ddH2O hingga volumenya tepat 1 L

Untuk membuat 1 L larutan Stok TE Buffer 10X, campurkan larutan-larutan berikut ini:

• 100 ml Tris-HCl 1 M pH 7.5
• 20 ml EDTA 500 mM pH 8.0
• 880 ml ddH2O

Larutan diaduk hingga bercampur sempurna.
Larutan TE Buffer dapat disterilkan menggunakan autoclave.

ddH2O

ddH2O atau disebut juga aqua bidestillata atau ultrapure water, adalah air yang sangat murni, lebih murni dari aquadest atau pun air reverse osmosis karena telah melalui berbagai macam cara pemurnian. Pada awalnya orang melakukan destilasi kembali pada air yang telah didestilasi, namun saat ini digunakan kombinasi berbagai jenis pemurnian untuk memperoleh ultrapure water ini (Artikel tentang tingkat kemurnian air dapat dilihat selengkapnya di sini).

Secara umum ddH2O dibuat dengan melewatkan aquadest ke dalam suatu cartridge berisi resin-resin filter dan deionisasi untuk menghilangkan ion-ion dari air, hingga diperoleh nilai hantaran listrik yang sangat kecil (sekitar 5.5 × 10⁻⁶ S·m⁻¹ atau 18 MΩ cm), terakhir air tersebut dilewatkan melalui filter membran dengan pori-pori 0.22 µl. Biasanya ddH2O tidak perlu disterilkan lagi menggunakan autoclave.

Mana yang Lebih Baik?

Kedua pelarut di atas paling umum digunakan untuk melarutkan DNA atau RNA, karena keduanya dapat melarutkan DNA atau RNA dengan baik. Namun untuk alasan stabilitas dan tujuan pemakaian DNA atau RNA, maka keduanya memiliki keunggulan dan kelemahan masing-masing.

DNA atau RNA akan lebih stabil jika dilarutkan dalam TE buffer karena pH-nya djaga sekitar 8. Ingat bahwa fungsi utama buffer adalah menyangga pH pada nilai tertentu. Jika dilarutkan dalam ddH2O, ada peluang untuk berubahnya pH. Ini dapat terjadi karena DNA dan RNA memiliki sifat asam lemah (ingat: DNA=asam deoksiribonukleat, RNA=asam ribonukleat), yang dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi DNA/RNA, apalagi DNase juga bekerja pada pH yang sedikit asam. Jadi untuk alasan kestabilan, buffer TE lebih unggul dibanding ddH2O.

Meskipun TE buffer membuat stabil DNA, tapi kita harus berhati-hati jika DNA atau RNA tersebut akan digunakan untuk aplikasi enzimatis seperti PCR (Polymerase Chain Reaction). Kenapa begitu? Karena TE buffer mengandung EDTA, yang dapat membentuk senyawaan kompleks dengan ion logam seperti Mg2+. Dalam hal ini EDTA merupakan chelating agent. Padahal Mg2+ adalah prekursor untuk enzim Taq DNA polymerase yang digunakan pada reaksi PCR, jadi kalau jumlah EDTA pada larutan DNA atau RNA cukup banyak, bisa menyebabkan reaksi PCR menjadi terhambat karena enzim DNA polymerase-nya tidak dapat bekerja secara sempurna. Jadi utk alasan ini, ddH2O lebih unggul dibanding TE buffer karena ddH2O tidak mengandung chelating agent.

Jadi, aplikasi lanjutan dari sampel DNA atau RNA akan menentukan pilihan kita. Jika DNA atau RNA akan segera digunakan untuk aplikasi PCR, lebih baik menggunakan ddH2O sebagai pelarut. Jika bukan dan akan disimpan dalam waktu yang cukup lama, TE buffer lah pilihannya. Tapi bisa saja kita mengakalinya dengan mengganti TE buffer dengan Tris-HCl buffer pH 8 karena tidak mengandung EDTA. Larutan Tris-HCl buffer ini sering digunakan sebagai elution buffer pada kit-kit purifikasi DNA/RNA komersial.

Satu hal lagi yang harus diingat, TE buffer atau ddH2O yang digunakan untuk melarutkan RNA harus bebas RNase, yaitu yang sudah di-treatment dengan DEPC (Diethyl Pyrocarbonate).

Selain itu, faktor penyimpanan juga sangat berpengaruh terhadap kestabilan larutan DNA atau RNA. Hal-hal berikut harus diperhatikan:

• Simpanlah larutan DNA atau RNA pada suhu -20oC atau -80oC (untuk RNA)
• Jangan sering-sering melakukan freeze-thaw, lebih baik melakukan aliquot dengan membagi larutan DNA atau RNA ke dalam beberapa tabung dengan volume lebih kecil.

So, apakah ada argumen lain yang bisa diungkapkan? Silakan tinggalkan komentar untuk kami.

Istilah pencarian terpopuler untuk artikel ini:

fungsi EDTA (148) | ddh2o (73) | FUNGSI BUFFER (52) | dna precipitation (47) | te buffer (39) | fungsi larutan buffer (23) | fungsi ddH2O (8) | pengertian buffer tris (5) | fungsi buffer pada PCR (5) | larutan te (4) | dna ethanol precipitation (4) | fungsi buffer tris hcl (4) | pembuatan tris-hcl (4) | fungsi buffer tris-hcl (4) | dna precipitate image (3) | ethanol precipitation dna (3) | fungsi aquabides(ddh2o) (3) | fungsi larutan TE pada PCR (3) | fungsi tabung reaksi (3) | fungsi Tris HCL pH 8 dalam ekstrak (3) |

Berbagai Larutan Buffer

Bicara tentang analisa bioteknologi, salah satu hal yang sedikit merepotkan adalah buffer. Buffer atau larutan penyangga adalah larutan yang terdiri dari asam lemah dan garam-nya yang dapat mempertahankan dan menjaga pH. Bidang bioteknologi tidak bisa dipisahkan dari penggunaan larutan ini.

Kebutuhan buffer kadang menyulitkan karena hampir setiap analisa membutuhkan kondisi pH tertentu yang relatif stabil. Karena banyaknya macam dan jenis buffer, pemilihan buffer yang akan digunakan menjadi masalah tersendiri.

Dalam memilih buffer, yang harus diperhatikan adalah pH optimum serta sifat-sifat biologisnya. Banyak jenis buffer yang mempunyai impact terhadap sistem biologis, aktivitas enzim, substrate, atau kofaktor.

Sebagai contoh buffer phosphat akan menghambat aktivitas dari beberapa metabolik enzim termasuk karboksilase, fumarase, dan phosphoglucomutase. Barbiturate menghambat phophorilasi oksidatif. Tris buffer bereaksi dengan amin primer dan memodifikasi transport elektron dan phosphorilasi pada kloroplast. Tris juga menghambat enzim respirasi di mitokondria. Dan masih banyak efek lain yang diberikan buffer. Oleh karena itu pemilihan buffer terkadang menjadi kesulitan yang cukup merepotkan. Oleh karena itu, gunakan konsentrasi buffer serendah mungkin yang masih dapat untuk memaintain pH.

Berikut beberapa macam buffer yang kerap digunakan:

GLYCINE-HCL; PH 2.2-3.6, PK_A = 2.35

Campur 25 ml 0.2 M glycine dan x ml HCl, kemudian encerkan hingga 100 ml dengan air suling.

x (ml)	pH
22.0	2.2
16.2	2.4
12.1	2.6
8.4	2.8
5.7	3.0
4.1	3.2
3.2	3.4
2.5	3.6

SODIUM ACETATE; PH 3.6-5.6, PK_A = 4.76

Mencampurkan 0.1N acetic acid dan 0.1N sodium acetate untuk mencapai pH tertentu.

acetic acid (ml)	sodium acetate (ml)	pH
185	15	3.6
176	24	3.8
164	36	4.0
147	53	4.2
126	74	4.4
102	98	4.6
80	120	4.8
59	141	5.0
42	158	5.2
29	171	5.4
19	181	5.6

BUFFERED SALINE (PBS, TBS, TNT, PBT)

Larutan buffer saline sering digunakan ketika melakukan eksperiment yang berhubungan dengan immunolocalization. Ada beberapa variasi dari buffer ini, tiga diantaranya sebagai berikut.

PBS 20x stock			TBS
Potassium chloride	4 g	53.6 mM	Potassium chloride 4 g
NaCl	160 g	274 mM	NaCl 160 g
Potassium phosphate monobasic	4 g	29.4 mM	Tris buffer (10 mM, pH 7.5) to 1 liter
Sodium phosphate dibasic (7•H2O) DI	43.2 g	17.5 mM to 1 liter	Use TBS when performing immunocytochemical
			experiments on phosphate-sensitive tissues
			(photosynthetic tissues typically)
TNT			PBT
NaCl	150 mM		PBS to vol
Tris buffer (100 mM, pH 7.5)	to 1 liter		Tween 20 1% (v/v)

CACODYLATE BUFFER; PH 5.0-7.4, PK_A = 6.27

Sodium cacodylate buffer [Na(CH3)2 AsO2 • 3H2O] adalah alternatif dari Sørensen’s phosphate buffer. Mempunyai kapasitas buffer yang baik pada range pH 5.0-7.4. Cacodylate digunakan untuk aplikasi mikroskop elektron sebagai metode untuk menghindari penambahan phosphate saat sample preparasi. Mitochondria dan arganela lainnya dapat rusak jika terkena konsentrasi phosphate berlebih yang terdapat dalam Sørensen’s buffers.

Siapkan 0.2 M sodium cacodylate stock solution dalam air (4.28 g/100 ml). Tambahkan x ml 0.2 N HCL per 100 ml cacodylate stock solution, diikuti denga penambahan air demin sampai volume 400 ml hingga diperoleh 0.05 M cacodylate buffer pada pH yang diinginkan.

0.2 M HCl	pH
94.0	5.0
90.0	5.2
86.0	5.4
78.4	5.6
69.6	5.8
59.2	6.0
47.6	6.2
36.6	6.4
26.6	6.6
18.6	6.8
12.6	7.0
8.4	7.2
5.4	7.4

CITRATE BUFFER; PH 3.0-6.2, PK_A = 6.40

Citrate buffer stock solutions: A: 0.1 M citric acid; B: 0.1 M sodium citrate. Campurkan kedua larutan dengan perbandingan volume dan encerkan dengan air sampai 100 ml untuk membuat pH yang diinginkan.

0.1 M citric acid	0.1 M sodium citrate	pH
46.5	3.5	3.0
43.7	6.3	3.2
40.0	10.0	3.4
37.0	13.0	3.6
35.0	15.0	3.8
33.0	17.0	4.0
31.5	18.5	4.2
28.0	22.0	4.4
25.5	24.5	4.6
23.0	27.0	4.8
20.5	29.5	5.0
18.0	32.0	5.2
16.0	34.0	5.4
13.7	36.3	5.6
11.8	38.2	5.8
9.5	41.5	6.0
7.2	42.8	6.2

SØRENSEN’S PHOSPHATE BUFFER; PH 5.8-8.0, PK_A = 7.20

Campur sejumlah tertentu stock solution dan tambahkan air suling untuk mendapatkan 100 ml larutan Sørensen’s phosphate buffer 0.1 M. Ingat, konsentrasi phosphate yang tinnggi dapat bersifat toksik bagi sel tanaman.

Stock solutions: A 0.2 M NaH₂PO₄ B 0.2 M Na₂HPO₄

A (ml)	B (ml)	pH
92.0	8.0	5.8
87.7	12.3	6.0
81.5	18.5	6.2
68.5	31.5	6.5
62.5	37.5	6.6
56.5	43.5	6.7
51.0	49.0	6.8
45.0	55.0	6.9
39.0	61.0	7.0
33.0	67.0	7.1
28.0	72.0	7.2
23.0	77.0	7.3
19.0	81.0	7.4
16.0	84.0	7.5
8.5	91.5	7.8
5.3	94.7	8.0

PHOSPHATE-CITRATE BUFFER; PH 2.2-8.0, PK_A = 7.20/6.40

Untuk membuat 100 ml larutan buffer phosphat-citrate. Stock solutions:

0.2 M dibasic sodium phosphate; 0.1 M citric acid.

0.2 M Na2HPO4 (ml)	0.1 M citrate (ml)	pH
5.4	44.6	2.6
7.8	42.2	2.8
10.2	39.8	3.0
12.3	37.7	3.2
14.1	35.9	3.4
16.1	33.9	3.6
17.7	32.3	3.8
19.3	30.7	4.0
20.6	29.4	4.2
22.2	27.8	4.4
23.3	26.7	4.6
24.8	25.2	4.8
25.7	24.3	5.0
26.7	23.3	5.2
27.8	22.2	5.4
29.0	21.0	5.6
30.3	19.7	5.8
32.1	17.9	6.0
33.1	16.9	6.2
34.6	15.4	6.4
36.4	13.6	6.6
40.9	9.1	6.8
43.6	6.5	7.0

BARBITAL BUFFER; PH 6.8-9.2, PK_A = 7.98

Untuk membuat 200 ml larutan buffer. Kedalam 50 ml Sodium barbital 0.2 M, tambahkan x ml 0.2 M HCl. Tambahkan air suling hingga volume 200 ml.

0.2 M HCl (x ml)	pH
1.5	9.2
2.5	9.0
4.0	8.8
6.0	8.6
9.0	8.4
12.7	8.2
17.5	8.0
22.5	7.8
27.5	7.6
32.5	7.4
39.0	7.2
43.0	7.0
45.0	6.8

TRIS BUFFERS

Solution	Preparation
Tris, 1 M stock	121.1 g Tris base dilute with 800 ml DI Dissolve and adjust pH with the following approximate amount of HCl: 70 ml pH 7.4, 60 ml pH 7.6, 42 ml pH 8.0.
EDTA, 0.5 M	186.1 g Disodium ethylene diamine tetraacetate. Adjust pH to approx. 8.0 and stir until dissolved
SSC, 20x	175.3 g NaCl, 88.2 g NaCitrate dilute with 800 ml DI. Adjust pH to 7.0 with NaOH then add DI to 1 liter
SSPE, 20x	174 g NaCl, 27.6 g NaH2PO4 • H2O,  7.4 g EDTA, dilute with 800 ml DI. Adjust pH to 7.4 with NaOH then add DI to 1 liter
TE	10 mM Tris and 1 mM EDTA Adjust pH using Tris stock solution.
STE (TNE)	10 mM Tris, 100 mM NaCl, and 1 mM EDTA Adjust pH to 8.0 using Tris stock solution

GLYCINE- NAOH BUFFER; PH 8.6-10.6, PK_A = 9.78

Stock solutions:

0.2 M glycine

0.2 NaOH

Campur  25 ml glycine stock solution dengan x ml 0.2 M NaOH dan encerkan dengn air suling hingga volume 100 ml.

x ml 0.2 M NaOH	pH
2.0	8.6
3.0	8.8
4.4	9.0
6.0	9.2
8.4	9.4
11.2	9.6
13.6	9.8
19.3	10.4
22.75	10.6

Demikian beberapa buffer yang bisa dijadikan pilihan untuk digunakan. Perlu diingat, bahwa larutan buffer hanya berfungsi untuk mempertahankan pH. Ini tidak berarti bahwa pH tidak akan berubah. Perubahan dan gangguan yang besar dalam sistem dapat merubah pH meskipun telah ditambahkan buffer ke dalamnya.

Hal ini karena buffer hanya menjaga agar pH tidak terlalu berubah signifikan dengan adanya perubahan konsentrasi ion hidrogen dalam sistem.

Istilah pencarian terpopuler untuk artikel ini:

larutan buffer (699) | contoh larutan buffer (220) | larutan penyangga (119) | larutan buffer adalah (74) | cara pembuatan larutan buffer (64) | pembuatan larutan buffer (61) | larutan PBS (61) | cara membuat larutan buffer (61) | kapasitas buffer (59) | kapasitas larutan penyangga (56) | aplikasi buffer (54) | jenis-jenis buffer (46) | buffer fosfat (45) | sistem buffer (41) | larutan buffer pdf (39) | macam-macam larutan buffer (38) | buffer (27) | aplikasi larutan buffer (25) | kapasitas larutan buffer (22) | larutan bufer (22) |