Archive for: dna

Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular

Gel Electrophoresis; image from http://clearlyexplained.com/culture/health/electrophoresisgel.jpg

Saat ini, teknik pemisahan dan pemurnian DNA/RNA merupakan teknik yang tidak dapat dipisahkan dari biologi molekular. Hampir semua penelitian DNA/RNA mesti melibatkan pemisahan dan pemurnian yang tekniknya cukup beragam. Elektroforesis adalah salah satu teknik pemisahan paling populer, maka tak heran jika elektroforesis disebut sebagai pintu gerbang dari berbagai penelitian biologi molekular. Nah, sekarang ada baiknya kita telusuri dulu teknik-teknik tersebut dari masa ke masa.

Oh ya, pada prinsipnya elektroforesis itu adalah teknik pemisahan campuran molekul yang didasarkan pada perbedaan muatan listriknya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fasa diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda.

Elektroforesis dengan Kertas Saring

[simage=233,160,y,right]

Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Bagaimana keduanya bisa mengungkap rahasia ini?

[simage=232,200,y,left]

Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu mereka namakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.

Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, mereka dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.

Elektroforesis Gel Kanji

[simage=234,200,y,left]

Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu.

Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida.  Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.

Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE)

[simage=236,200,y,left]

Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar.

Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.

Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)

[simage=235,200,y,left]

Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor membeberkan ide cerdasnya untuk memisahkan campuran DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada patogen.

Keempat teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian lainnya dalam bidang biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit dibayangkan sebuah laboratorium biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA yang sedang kita teliti akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan, sulit pula membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis selain dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun sangat bergantung pada teknik elektroforesis ini. Terima kasih kepada Markham dan Smith yang telah mencoba meneteskan RNA hidrolisat pada selembar kertas saring dan memisahkannya dengan arus listrik.

Sumber:

• Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group.
• http://dukeresearch.blogspot.com/2009/04/flipping-through-chronicles-of-nobel.html

Sang Penemu 23 Kromosom dari Indonesia

Kromosom Manusia; image from http://www.nature.com/nrg/journal/v7/n8/thumbs/nrg1917-f5.jpg

Siapa sangka seorang ilmuwan dari Indonesia ternyata berperan penting dalam perkembangan bioteknologi khususnya genetika. Dia bersama koleganyalah yang menemukan dan memastikan bahwa kromosom manusia berjumlah 23 pasang, padahal sebelumnya para ilmuwan meyakini bahwa jumlah kromosom manusia adalah 24. Nah lho!

Kisahnya bermula tahun 1921, ada 3 orang yang datang kepada Theophilus Painter meminta untuk dikebiri. Dua pria kulit hitam dan seorang pria kulit putih itu merelakan ‘senjata’ mereka dicopot berdasarkan kepercayaan yang mereka anut. Painter yang orang Texas ini lantas mengamati isi testis ketiga orang tadi, dia sayat tipis-tipis, lalu diproses dengan larutan kimia, dan dia amati di bawah mikroskop. Ternyata ia melihat ada serabut-serabut kusut yang merupakan kromosom tak berpasangan pada sel testis. Hitungan dia saat itu ada 24 kromosom. Dia sangat yakin, ada 24.

‘Keyakinan’ ini dikuatkan oleh ilmuwan lain yang mengamati dengan cara berbeda, mereka pun mendapat hasil yang sama, 24 kromosom. Bahkan hingga 30 tahun ‘keyakinan’ ini bertahan. Begitu yakinnya para ilmuwan akan hitungan ini sampai-sampai ada sekelompok ilmuwan meninggalkan penelitian mereka tentang sel hati manusia karena mereka tidak menemukan kromosom ‘ke-24′ dalam sel tersebut, mereka ‘hanya’ menemukan 23 saja. Ilmuwan lain berhasil memisah-misahkan kromosom manusia dan menghitungnya, jumlahnya? Tetap 24 pasang.

Barulah 34 tahun setelah ‘tragedi’ pengebirian oleh Painter, ilmuwan menemukan cara untuk memastikan bahwa jumlah kromosom manusia hanya ada 23, bukan 24. Adalah Joe-Hin Tjio yang bermitra dengan Albert Levan di Spanyol menemukan teknik yang lebih baik untuk mendapatkan jumlah 23 pasang kromosom manusia. Bahkan ketika mereka menghitung ulang gambar eksperimen terdahulu yang menyebutkan bahwa jumlahnya ada 24, mereka mendapati hanya ada 23. Benar-benar aneh, mata siapa yang bisa error begini?

Dan memang kenyataan bahwa manusia hanya memiliki 23 pasang kromosom dianggap aneh dan mengejutkan. Pasalnya, simpanse, orang utan dan gorila, yang kandungan genetiknya mirip dengan manusia memiliki 24 pasang kromosom. Jadi kromosom manusia ini lain daripada bangsa ungka (ape) yang lain. Dan usut punya usut, ternyata ada dua kromosom pada gorila yang jika digabungkan ukurannya akan mirip dengan kromosom 2 pada manusia. Sungguh ajaib memang, perbedaan yang ‘kecil’ ini ditambah sedikit keragaman antara gen-gen manusia dan gorila, membuat ‘penampakan’ keduanya jauh berbeda.

Oh ya, kembali ke sang penemu 23 pasang kromosom pada manusia, salah satunya, yaitu Joe-Hin Tjio, adalah orang Indonesia.

Sekilas Joe-Hin Tjio

[simage=223,144,y,left]
Seperti ditulis dalam Encyclopædia Britannica, Tjio (diucapkan CHEE-oh) lahir di Jawa tanggal 2 November 1919. Tjio kecil bersekolah di sekolah penjajah Belanda, kemudian dia sempat mendalami fotografi mengikuti jejak ayahnya yang juga seorang fotografer profesional. Namun selanjutnya Tjio memutar stir ke bidang pertanian dengan kuliah di Sekolah Ilmu Pertanian di Bogor, waktu itu Tjio berusaha mengembangkan tanaman hibrida yang tahan terhadap penyakit. Dari sinilah pondasi ilmu genetika membawanya menjadi seorang ahli genetik terkemuka kelak.

Sempat dipenjara selama tiga tahun saat masa pendudukan Jepang, Tjio melanjutkan pendidikannya ke Belanda melalui program beasiswa. Ia melanjutkan kembali studinya mengenai cytogenetik tanaman dan serangga hingga menjadi ahli dalam bidang tersebut. Kemudian Tjio menghabiskan waktu 11 tahun di Zaragoza setelah pemerintah Spanyol mengundangnya untuk melakukan studi dalam program peningkatan mutu tanaman. Di sela-sela liburannya, Tjio pun nyambi riset di Institute of Genetics di Lund Swedia dan tertarik untuk meneliti jaringan sel mamalia. Di sinilah penemuannya yang menghebohkan itu ia lakukan. Pada tahun 1955, Tjio menggunakan suatu teknik yang baru ditemukan untuk memisahkan kromosom dari inti (nukleus) sel, ia merupakan salah satu peletak pondasi cytogenetik modern –ilmu yang mempelajari hubungan antara struktur dan aktifitas kromosom serta mekanisme hereditas– sebagai sebuah cabang utama ilmu genetika. Penelitiannya yang lain pada tahun 1959 membawa pada penemuan bahwa orang-orang yang terkena Down Syndrome memiliki tambahan kromosom dalam sel-sel mereka.

Ada cerita menarik di balik penemuan jumlah 23 pasang kromosom ini, selain memang hasil penelitiannya yang menghebohkan, Tjio pun melakukan tindakan yang cukup menggemparkan dunia riset Eropa karena ia menolak untuk mencantumkan Albert Levan (kepala Institute of Genetics tempat risetnya dilakukan) sebagai Author utama dalam jurnal yang diterbitkan dalam Scandinavian Journal Hereditas tahun 1956 itu, padahal itu sesuatu yang ‘wajib’ sesuai konvensi Eropa yang telah berlangsung lama. Tjio bahkan mengancam akan membuang pekerjaannya itu jika Tjio tidak dicantumkan sebagai Author utama. Akhirnya, mengingat ini adalah penemuan besar, Levan mengalah dan dia dicantumkan hanya sebagai co-author.

[simage=222,160,y,right]
Di sisa 37 tahun terakhir karirnya, Tjio bekerja di NIH (National Institute of Health) Washington. Di sana Tjio mengkompilasi koleksi-koleksi foto-foto ilmiah yang mendokumentasikan penelitian-penelitiannya yang luar biasa. Ternyata bakat fotografi terpendamnya tersalurkan juga di NIH. Prestasi Tjio pun tak bisa dipandang remeh, bahkan sangat membanggakan, terbukti dengan anugerah Outstanding Achievement Award dari Presiden Kennedy tahun 1962.

Tjio tutup usia tanggal 27 November 2001, 25 hari setelah ultahnya yang ke 82 di Gaithersburg, Maryland, Amerika. Kita boleh berbangga sekaligus prihatin, bangga karena ilmuwan kelahiran Indonesia mampu memberi sumbangsih besar untuk ilmu pengetahuan, tapi juga prihatin karena di negeri kita ‘belum’ menjadi tempat bagi ilmuwan luar biasa. Banyak potensi besar orang-orang cerdas yang kurang diperhatikan, sehingga mereka ‘dibajak’ oleh negara-negara lain yang sudah maju dan mau menghargai kehebatan mereka, bahkan sejak mereka masih sangat muda. Tentu sayang jika orang hebat seperti Joe-Hin Tjio yang lahir di Jawa pada akhirnya dikenal sebagai ahli genetik Amerika.

Sumber:

• “Ridley, Matt.” Genom; Kisah Spesies Manusia dalam 23 bab. 2009. Gramedia Pustaka Utama
• Wikipedia
• “Tjio, Joe Hin.” Encyclopædia Britannica. 2009. Encyclopædia Britannica Online. 16 May. 2009 <http://www.britannica.com/EBchecked/topic/761383/Joe-Hin-Tjio>.

Important Terms Related to Microarrays

DNA Microarrays

Gene Expression

• With only a few exceptions, every cell of the body contains a full set of chromosomes and identical genes.
• Gene expression is a highly complex and tightly regulated process that allows a cell to respond dynamically both to environmental stimuli and to its own changing needs.
• This mechanism acts as both an “on/off” switch to control which genes are expressed in a cell as well as a “volume control” that increases or decreases the level of expression of particular genes as necessary.

Central Dogma of Molecular Biology

Transcription

Transcription is the process by which the information contained in a section of DNA is transferred to a newly assembled piece of messenger RNA (mRNA). Transciption is consisted of three steps:

Initiation

Elongation

Termination

mRNA

Messenger ribonucleic acid (mRNA) is a molecule of RNA encoding a chemical “blueprint” for a protein product. mRNA is transcribed from a DNA template, and carries coding information to the sites of protein synthesis: the ribosomes.

Polyadenylation

• Polyadenylation is the covalent linkage of a polyadenylyl moiety to a messenger RNA molecule at 3’ end (3′ poly(A) tail).
• Protecting mRNA from degradation by exonucleases.
• Important for transcription termination, export of the mRNA from the nucleus, and translation.
• Occurs during and immediately after transcription of DNA into RNA.

Reverse Transcription

• Reverse Transcription is the transfer of information from RNA to DNA (the reverse of normal transcription).
• This is known to occur in the case of retroviruses, such as HIV, and, in higher eukaryotes, in the case of retrotransposons.
• It is not, however, the general case in most living organisms.

Complementary DNA (cDNA)

• cDNA is DNA synthesized from a mature mRNA template in a reaction catalyzed by the enzyme reverse transcriptase.
• This enzyme operates on a single strand of mRNA, generating its complementary DNA based on the pairing of RNA base pairs (A, U, G and C) to their DNA complements (T, A, C and G respectively).
• We can use oligo dT(n) or random oligo as primer.

Oligonucleotide synthesis

• Oligonucleotide systhesis is the non-biological, chemical synthesis of defined short sequences of nucleic acids Automated synthesizers allow the synthesis of oligonucleotides (typically single stranded) up to 160 to 200 bases
• Commonly used as primers, probes and to generate restriction sites

Nucleic acid hybridization

• Hybridization is the process of combining complementary, single-stranded nucleic acids into a single molecule.
• Nucleotides will bind to their complement under normal conditions, so two perfectly complementary strands will bind to each other readily.
• Southern and Northern blotting are the exist two kind of nucleic acid hybridization

Fluorescence

Fluorescence is a luminescence that is mostly found as an optical phenomenon in cold bodies, in which the molecular absorption of a photon triggers the emission of another photon with a longer wavelength.

Fluorophore

Fluorophore is a component of a molecule which causes a molecule to be fluorescent. It is a functional group in a molecule which will absorb energy of a specific wavelength and re-emit energy at a different (but equally specific) wavelength.

DNA Labeling

• DNA Labeling is an addition of a chemical into DNA strand to make them visualizable.
• A label can be a radioactive compound or a fluorophore.
• The most famous fluorophore family used in Microarray experiment is Cyanine (Cy),there are two mostly used of Cy compounds, Cy3 and Cy5.

Presentation format of this article is available here

Mengenal PCR (Polymerase Chain Reaction)

Tentu Anda sudah mengenal yang namanya DNA. DNA ini sering disebut-sebut terutama berkaitan dengan kriminalitas, diagnosa penyakit, penentuan ‘keabsahan’ keturunan, dll. Mungkin Anda bingung bagaimana caranya polisi bisa mengungkap pelaku kejahatan dengan berbekal sehelai rambut pelaku yang tercecer di TKP, atau dari tetesan sperma pemerkosa yang mengering di tubuh korban. Padahal kan sampel yang dianalisa jumlahnya sangat sedikit, ajaib!

Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction. Proses yang berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 µl ini mampu menggandakan atau mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula. Maka pantes aja dengan berbekal DNA yang terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai kebutuhan kita.

Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase.

PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Nah, sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali, dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup, 2 pangkat 30 alias 1.073.741.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu, kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi, tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.

Komponen PCR

Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:

Primer

Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.

dNTP (deoxynucleoside triphosphate)

dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.

Buffer

Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.

Ion Logam

• Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.
• Ion logam monovalen, kalsium (K+).

Tahapan Reaksi

Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:

Denaturasi

Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.

Annealing

Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.

Ekstensi/elongasi

Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.

Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:

Pra-denaturasi

Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).

Final Elongasi

Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir

PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.

Aplikasi teknik PCR

Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

Isolasi Gen

Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu apaan ya?

Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.

Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.

Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga [http://www.littletree.com.au/dna.htm]. Dan ajaib! Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi.

Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.

DNA Sequencing

Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.

Forensik

Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.

Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.

Diagnosa Penyakit

Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.

PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.

Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun setelah penemuannya (1993).

Sumber: Wikipedia, Andy Vierstraete dan sumber-sumber lainnya.

Tanya Jawab Seputar Analisa DNA Sequencing

1. Apakah Sanger Dideoksi Sequencing itu dan apa bedanya dengan Fluorescent Sequencing Applied Biosystems?

Dengan Sanger Sequencing, DNA polymerase menyalin utas tunggal cetakan (template) DNA, dengan penambahan nukleotida kepada rantai yang terbentuk (produk ekstensi). Permanjangan rantai terjadi pada ujung 3′ dari primer, oligonukleotida yang menempel (anneal) pada template. Deoksinukleotida yang ditambahkan pada produk ekstensi dipilih berdasarkan pasaan basa yang cocok dengan template. Produk ekstensi tumbuh dengan pembentukan jembatan fosfodiester antara gugus 3′-hydroksil pada ujung primer yang memanjang dan gugus 5′-fosfat dari deoksinukleotida yang masuk (Watson et al, 1987). Pemanjangan terjadi pada arah 5′ -> 3′ (lihat gambar 7).

DNA polymerase dapat berinkorporasi juga dengan basa nukleotida analognya. Metode dideoksi pada DNA sequencing yanG dikembangkan oleh Sanger et al. (1977) memanfaatkan keuntungan kemampuan ini dengan menggunakan 2′-3′-dideoksi sebagai substrat. Ketika sebuah dideoksinukleotida berinkorporasi pada ujung 3′ rantai yang sedang memanjang, pemanjangan rantai dihentikan secara selektif pada A, C, G atau T, karena rantai kekurangan gugus 3′-hidroksil (lihat gambar 8).

2. Apakah Cycle Sequencing itu?

Cycle Sequencing adalah sebuah metode sederhana dimana pengulangan denaturasi, annealing dan ekstensi secara berturut-turut dalam thermal cycler menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi (lihat gambar 9). Produk ini kemudian di-load kedalam del atau diinjeksikan ke dalam kapiler. Applied Biosystems menggunakan protokol cycle sequencing ini dalam kit DNA sequencingnya.

3. Apakah keuntungan dari cycle sequencing?

Keuntungannya adalah sebagai berikut:

• Protokolnya sangat baik dan mudah untuk dilakukan
• Cycle sequencing membutuhkan DNA template yang jauh lebih sedikit dibandingkan metode ekstensi temperatur tunggal.
• Cycle sequencing lebih sesuai dibandingkan metode pelabelan temperatur tunggal tradisional yang membutuhkan langkah denaturasi kimiawi untuk template utas ganda.
• Temperatur yang tinggi mengurangi struktur sekunder sehingga ekstensi berjalan lebih sempurna
• Temperatur tinggi mengurangi annealing sekunder primer ke template
• Protokol yang sama digunakan untuk DNA utas ganda maupun utas tunggal
• Protokol ini bekerja dengan baik untuk sequencing langsung PCR produk
• Template-template yang sulit, seperti bacterial artificial chromosomes (BACs), dapat disekuen

4. Apakah Dye Terminator Cycle Sequencing itu?

Dengan pelabelan dye terminator, masing-masing keempat dideoxy terminators (ddNTPs) ditandai dengan suatu fluorescent dye yang berbeda-beda. Rantai yang tumbuh diterminasi dan dilabel secara simultan dengan dye yang berkorespondensi dengan basa tersebut (lihat gambar 10). Suatu primer yang tidak dilabel dapat digunakan. Reaksi dye terminator dapat dilakukan dalam sebuah tabung. Protokol ini membutuhkan langkah pemipetan yang lebih sedikit dibanding reaksi dye primer. Reaksi yang dilabel dengan empat warna dye di-load dalam sebuah lajur gel tunggal atau satu injeksi kapiler. Jika terjadi kesalahan terminasi, yaitu fragmen yang tidak diterminasi oleh dideoksinukleotida, maka tidak akan terdeteksi karena tidak ada dye yang menempel.

5. Apakah Dye Primer Cycle Sequencing itu?

Dengan pelabelan dye primer, primer ditandai dengan empat pewarna fluorescent yang berbeda. Produk terlabel terbentuk dalam empat reaksi spesifik basa yang berbeda. Produk dari keempat reaksi ini lalu dicampur dan di-load kedalam satu lajur gel atau satu injeksi kapiler (lihat gambar 11). Dye primer chemistries umumnya menghasilkan intensitas sinyal yang lebih baik dibanding dye terminator chemistries. Primer yang terlabel tersedia secara komersial untuk situs-situs primer yang umum. Kita dapat juga melabel custom primer. Reaksi yang dilabel dengan empat warna dye di-load ke dalam lajur tunggal atau satu injeksi kapiler.

6. Apakah Matrix Standard itu?

Overlap spektral yang presisi antara keempat dye diukur dengan menjalankan (running) fragmen DNA yang dilabel menggunakan masing-masing dye dalam kalibrasi spektral pada mesin ABI PRISM® Genetic Analyzer. Fragmen DNA yang dilabel dye ini dinamakan matrix standards. Software Data Utility kemudian menganalisa data dari sample matrix standard dan membuat file matrix. Nomor-nomor ini adalah internetan fluorescent yang dinormalisasi dan merepresentasikan suatu deskripsi matematis overlap spektral yang teramati diantara dye-dye. File-file matrix dalam file instrumen digunakan untuk jenis chemistry yang spesifik, dan menyediakan informasi bagi software Sequence Analysis sehingga memungkinkannya untuk mengkoreksi overlap spektral.

7. Apakah BAC End-Sequencing itu?

Bacterial artificial clones alias BAC adalah segmen besar DNA (100kb-200kb) yang diklonkan ke dalam bakteri dari spesies lain. Beberapa salinan dapat dibuat setelah kloning. Sekuen dari ujung BAC menyediakan penanda yang sangat spesifik. Sekuen ini kemudian dapat dibandingkan dengan pustaka BAC untuk konformasi.

8. Apakah yang dimaks dengan “Checking Clone Constructs”?

Ini merupakan cara untuk memverifikasi bahwa DNA yang kita inginkan sudah diklon dengan baik kedalam vektor menggunakan DNA sequencing.

9. Apakah Multicomponent Analysis itu?

Multicomponent analysis merupakan proses yang memisahkan keempat warna dye fluorescent menjadi komponen-komponen spektral tersendiri. Meskipun setiap dye mengemisikan fluoresensi maksimumnya pada panjang gelombang yang berbeda, terdapat beberapa overlap pada spektrum emisi antara keempat dye (lihat gambar 12). Tujuan multicomponent analysis adalah mengisolasi signal dari setiap dye sehingga noise pada data menjadi sesedikit mungkin.

10. Apakah De Novo Sequencing itu?

Proses eksperimental penentuan urutan basa nukleotida suatu daerah (region) DNA dengan melabel setiap nukleotida dengan penanda fluorescent untuk mengidentifikasinya.

11. Apakah yang dimaksud dengan Multi-Locus Sequence Typing (MLST)?

MLST adalah suatu prosedur yang tidak ambigu untuk mengkarakterisasi isolat bakteri menggunakan sekuen fragmen internal dari 7 gen housekeeping. Prosedur ini menggunakan fragmen internal (~450-500 bp) dari setiap gen, sehingga mereka dapat disekuen pada kedua utasnya secara akurat dengan mesin DNA sequencer terotomatisasi. Untuk setiap gen housekeeping, sekuen-sekuen yang terdapat dalam suatu spesies bakteri dinyatakan sebagai alel yang jelas, dan untuk setiap isolat, alel pada masing-masing ketujuh loci mendefinisikan profice allelic atau jenis sekuen (IST)

12. Apakah yang dimaksud dengan Deteksi berbasis SNP atau Resequencing?

Sebuah heterozygote mengandung alel-alel yang berbeda pada suatu locus (posisi) pada kromosom homolog. Deteksi heterozygote dilakukan dengan primer spesifik.

13. Apakah HLA Typing itu?

Pengujian human leukocyte antigen (HLA) mendeteksi antigen-antigen (penanda genetik) pada sel darah putih. Terdapat 4 jenis human leukocyte antigens yaitu: HLAA, HLAB, HLAC, dan HLAD. Tes HLA menguji kompatibilitas jaringan dan penentuan jenis jaringan reseptor/donor. Tes ini juga digunakan pada konseling genetik dan pengujian paternitas. (hanya untuk riset.)

14.apakah Deteksi Metilasi itu?

Metilasi DNA terjadi pada situs CpG, yang mana sekuen DNA dengan sitosin berada dekat dengan guanin. Metilasi dimediasi oleh suatu enzim (DNA methyltransferase). Situs CpG jarang terdapat pada genom eukariot, kecuali pada wilayah yang dekat dengan promoter suatu gen eukariotik. Wilayah ini dikenal sebagai CpG islands, dan keadaan metilasi pada situs-situs CpG penting bagi aktifitas/ekspresi gen.

15. Apakah mtDNA sequencing itu?

mtDNA adalah kependekan dari mitokondria. Molekul mitokondrial terdapat dalam jumlah 100-1000 salinan per sel, lain dengan DNA inti yang terdapat hanya dua salinan per sel. Banyaknya mtDNA memungkinkan diskriminasi antara individu-individu atau sampel-sampel biologis, khususnya jika DNA inti rusak atau tidak tersedia.

16. Apakah yang dimaksud dengan Comparative Genomic Resequencing?

Comparative Genomic Resequencing adalah perbandingan genom-genom dan individu-individu dalam suatu genom. Comparative genomics memungkinkan aplikasi informasi yang diperoleh dari suatu genom sampel menjadi suatu genom yang lebih kompleks. Ini merupakan dasar untuk memahami variasi genetik dalam suatu populasi.

17. Apakah Deteksi Mutasi Non-SNP itu?

Mutasi deteksi Non-SNP adalah suatu Resequencing dimana perbandingan suatu sekuen dengan suatu sekuen referensi dilakukan menggunakan mutasi-mutasi Non-SNP, seperti insersi dan delesi.

18. Apakah Metode SAGE™ itu?

SAGE™ adalah sebuah motede untuk analisa kuantitatif, pola ekspresi gen pada genome. Suatu tag sekuen pendek (10 – 25 bp) mengandung informasi yang cukup untuk mengidentifikasi suatu transkrip.

19. Apakah yang dimaksud dengan profiling mutasi menggunakan analisa, deteksi atau validasi SNP itu?

Sebuah single nucleotide polymorphism (SNP) adalah substitusi satu basa atas yang lainnya. Beberapa metode berbasis sequencing tersedia untuk pencarian dan analisa SNP.

Diterjemahkan dengan modifikasi dari situs www.appliedbiosystems.com

Faktor Penentu Keberhasilan Analisa DNA sequencing

Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life science yang melibatkan analisa ini. Pencapaian terbesar teknologi DNA sequencing saat ini adalah terungkapnya urutan basa nukleotida yang menyusun genom manusia. Para peneliti yang menggunakan tools ini seringkali menghadapi masalah dalam melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak memuaskan. DNA sequencing menggunakan elektrophoresis kapiler merupakan teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science. Berikut ini adalah beberapa hal yang penting untuk diketahui yang menjadi faktor penentu keberhasilan analisa DNA Sequencing.

Ekstraksi DNA untuk DNA sequencing

Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample.

Desain Primer dan Amplifikasi

Urutan kerja DNA sequencing secara umum mengharuskan kita mengamplifikasi hasil ekstraksi DNA sample sebelum disekuen. Untuk mengamplifikasi DNA sample, kita membutuhkan DNA polymerase, nukleotida (dNTP), buffer reaksi, primer dan sebuah thermal cycler.

Sequencing Chemistries

Cycle sequencing merupakan metode sederhana yang mana terdiri atas proses denaturasi, annealing dan ekstensi yang berulang-ulang dalam sebuah mesin thermal cycler, menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi. Produk ini kemudian diinjeksikan ke dalam sebuah kapiler. Untuk Applied Biosystems, ada 2 kategori pendekatan sequencing chemistry: Dye Primer Chemistry dan Dye Terminator chemistry.

+Continue Reading