SYBR Green dye (image from vulgariz.com)
Kontributor: Yul Kurniatun
Kesadaran mengenai keamanan, telah mendorong pemilihan bahan yang aman dan ramah bagi personal laboratorium dan lingkungan. Contohnya pada praktek biologi molekuler. Sekarang tersedia alternatif pengganti ethidium bromide (EtBr) yang diklaim lebih aman, yaitu SYBR green. Tersedia di pasaran dengan nama dagang SYBR green I nucleic acid gel stain dan SYBRsafe dalam konsentrasi 10.000X.
Mengutip dari Wikipedia, SYBR green I bersifat 25X lebih sensitif dibandingkan EtBr. Sementara, SYBRsafe yang merupakan turunan dari SYBR green memiliki sensitifitas sama dengan EtBr. Namun potensi yang ada akan berkurang nilainya jika penggunaan bahan tidak dilakukan secara tepat.
+Continue Reading
Bakteri hasil kloning yang dapat berpendar (image from speakscience.org)
Melakukan klon suatu produk PCR (insert) ke plasmid dapat dilakukan dengan beberapa cara, bisa melalui TA cloning maupun dengan bantuan enzim restriksi. Namun seringkali situs enzim restriksi pada insert tidak cucok alias compatible dengan situs pada plasmid, sehingga perlu suatu cara untuk menambahkan situs enzim restriksi pada produk PCR agar bisa diklon dengan baik. Untuk itu kita perlu bantuan adapter.
Adapter yang dimaksud di sini adalah primer PCR biasa yang ditambahkan beberapa nukleotida pada bagian depannya (ujung 5′) yang membentuk situs enzim restriksi yang diinginkan. +Continue Reading
TA Cloning Diagram (Picture from wikimedia.org)
Produk PCR dapat diklon ke suatu vektor melalui “permainan gunting dan lem DNA” seperti yang pernah kami bahas sebelumnya. Ada beberapa pendekatan yang dapat dilakukan, yaitu melalui “blunt end” cloning, “TA” cloning dan “sticky end” cloning. Cara mana yang harus kita pilih? Yuk kita lihat apa untung rugi ketiga cara tersebut. +Continue Reading
PCR, sangat bergantung pada spesifitas primer (image from daysinutm.blogspot.com)
Pada artikel sebelumnya dengan judul “Yuk Mendesain Primer dengan Primer3Plus” telah dijelaskan langkah-langkah desain primer. Di sana dicontohkan bagaimana cara mendesain primer untuk mendeteksi keberadaan virus TMV (Tobacco Mozaic Virus) yang biasa menyerang tanaman tembakau dan jenis-jenis tanaman golongan Solanaceae.
Primer yang telah kita desain tersebut harus diuji spesifisitasnya agar kita yakin bahwa:
+Continue Reading
Molekul DNA
PCR alias Polymerase Chain Reaction adalah salah satu teknik yang paling banyak digunakan dalam biologi molekuler. Dengan PCR, DNA dalam jumlah yang sangat sedikit dapat kita lipatgandakan untuk selanjutya diidentifikasi, dimanipulasi dan bisa pula digunakan untuk keperluan forensik, diagnosis virus penyakit dan sebagainya.
Selain enzim Taq DNA Polymerase yang menjadi kunci pokok teknik PCR, ada satu komponen lagi yang tak kalah pentingnya, yaitu Primer PCR. Spesifisitas dan efisiensi PCR amat ditentukan oleh kualitas primer yang digunakan. Sekarang yuk kita bahas bagaimana caranya mendesain primer untuk PCR.
+Continue Reading
Mana yang lebih baik untuk melarutkan DNA/RNA? TE Buffer atau ddH2O? Pertanyaan ini seringkali muncul dan menjadi bahan diskusi yang menarik. Dan ternyata masing-masing memiliki kelebihan dan kelemahan sehingga pelarut mana yang dipilih amat bergantung pada tujuan kita melarutkan DNA/RNA.
DNA Precipitate | Image from http://www.biotechlearn.org.nz/
TE Buffer
TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. Berikut ini resep pembuatannya:
Larutan Tris-HCl 1 M pH 7.5
Untuk membuat 1 L larutan:
- Tambahkan 121.14 g Tris Base (BM = 121.14 g/mol) ke dalam 800 mL ddH2O
- Atur pH hingga mencapai pH 8.0 dengan larutan HCl 4N
- Tambahkan ddH2O hingga volumenya tepat 1 L
Catatan: Nama kimia dan nama lain dari Tris base adalah 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol, THAM, Tris(hydroxymethyl)aminomethane, atau Trometamol
Larutan EDTA 500 mM pH 8.0
Untuk membuat 1 L larutan:
- Tambahkan 186,12 g Sodium EDTA dihydrate (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) atau 146.12 g EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) ke dalam 800 mL ddH2O
- Atur pH hingga mencapai pH 8.0 dengan larutan NaOH 4 N
- Tambahkan ddH2O hingga volumenya tepat 1 L
Untuk membuat 1 L larutan Stok TE Buffer 10X, campurkan larutan-larutan berikut ini:
- 100 ml Tris-HCl 1 M pH 7.5
- 20 ml EDTA 500 mM pH 8.0
- 880 ml ddH2O
Larutan diaduk hingga bercampur sempurna.
Larutan TE Buffer dapat disterilkan menggunakan autoclave.
ddH2O
ddH2O atau disebut juga aqua bidestillata atau ultrapure water, adalah air yang sangat murni, lebih murni dari aquadest atau pun air reverse osmosis karena telah melalui berbagai macam cara pemurnian. Pada awalnya orang melakukan destilasi kembali pada air yang telah didestilasi, namun saat ini digunakan kombinasi berbagai jenis pemurnian untuk memperoleh ultrapure water ini (Artikel tentang tingkat kemurnian air dapat dilihat selengkapnya di sini).
Secara umum ddH2O dibuat dengan melewatkan aquadest ke dalam suatu cartridge berisi resin-resin filter dan deionisasi untuk menghilangkan ion-ion dari air, hingga diperoleh nilai hantaran listrik yang sangat kecil (sekitar 5.5 × 10−6 S·m−1 atau 18 MΩ cm), terakhir air tersebut dilewatkan melalui filter membran dengan pori-pori 0.22 µl. Biasanya ddH2O tidak perlu disterilkan lagi menggunakan autoclave.
Mana yang Lebih Baik?
Kedua pelarut di atas paling umum digunakan untuk melarutkan DNA atau RNA, karena keduanya dapat melarutkan DNA atau RNA dengan baik. Namun untuk alasan stabilitas dan tujuan pemakaian DNA atau RNA, maka keduanya memiliki keunggulan dan kelemahan masing-masing.
DNA atau RNA akan lebih stabil jika dilarutkan dalam TE buffer karena pH-nya djaga sekitar 8. Ingat bahwa fungsi utama buffer adalah menyangga pH pada nilai tertentu. Jika dilarutkan dalam ddH2O, ada peluang untuk berubahnya pH. Ini dapat terjadi karena DNA dan RNA memiliki sifat asam lemah (ingat: DNA=asam deoksiribonukleat, RNA=asam ribonukleat), yang dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi DNA/RNA, apalagi DNase juga bekerja pada pH yang sedikit asam. Jadi untuk alasan kestabilan, buffer TE lebih unggul dibanding ddH2O.
Meskipun TE buffer membuat stabil DNA, tapi kita harus berhati-hati jika DNA atau RNA tersebut akan digunakan untuk aplikasi enzimatis seperti PCR (Polymerase Chain Reaction). Kenapa begitu? Karena TE buffer mengandung EDTA, yang dapat membentuk senyawaan kompleks dengan ion logam seperti Mg2+. Dalam hal ini EDTA merupakan chelating agent. Padahal Mg2+ adalah prekursor untuk enzim Taq DNA polymerase yang digunakan pada reaksi PCR, jadi kalau jumlah EDTA pada larutan DNA atau RNA cukup banyak, bisa menyebabkan reaksi PCR menjadi terhambat karena enzim DNA polymerase-nya tidak dapat bekerja secara sempurna. Jadi utk alasan ini, ddH2O lebih unggul dibanding TE buffer karena ddH2O tidak mengandung chelating agent.
Jadi, aplikasi lanjutan dari sampel DNA atau RNA akan menentukan pilihan kita. Jika DNA atau RNA akan segera digunakan untuk aplikasi PCR, lebih baik menggunakan ddH2O sebagai pelarut. Jika bukan dan akan disimpan dalam waktu yang cukup lama, TE buffer lah pilihannya. Tapi bisa saja kita mengakalinya dengan mengganti TE buffer dengan Tris-HCl buffer pH 8 karena tidak mengandung EDTA. Larutan Tris-HCl buffer ini sering digunakan sebagai elution buffer pada kit-kit purifikasi DNA/RNA komersial.
Satu hal lagi yang harus diingat, TE buffer atau ddH2O yang digunakan untuk melarutkan RNA harus bebas RNase, yaitu yang sudah di-treatment dengan DEPC (Diethyl Pyrocarbonate).
Selain itu, faktor penyimpanan juga sangat berpengaruh terhadap kestabilan larutan DNA atau RNA. Hal-hal berikut harus diperhatikan:
- Simpanlah larutan DNA atau RNA pada suhu -20oC atau -80oC (untuk RNA)
- Jangan sering-sering melakukan freeze-thaw, lebih baik melakukan aliquot dengan membagi larutan DNA atau RNA ke dalam beberapa tabung dengan volume lebih kecil.
So, apakah ada argumen lain yang bisa diungkapkan? Silakan tinggalkan komentar untuk kami.
Primer merupakan salah satu bagian terpenting dalam reaksi PCR, Polymerase Chain Reaction merupakan teknik perbanyakan sample DNA yang mempunyai banyak kegunaan mulai dari sekuensing hingga forensik, aplikasi PCR ini dinilai sebagai teknik biomolekuler yang sangat bermanfaat sehingga penemu PCR ini Kary Mullis dianugerahi hadiah nobel dalam bidang kimia pada tahun 1993. Untuk mengenal lebih lanjut tentang PCR bisa merujuk ke tulisan ini. Saat ini terdapat banyak aplikasi komputer yang dapat digunakan membantu dalam desain primer ini dari yang sifatnya berbayar hingga yang gratis. PerlPrimer contohnya, adalah salah satu aplikasi yang kerap di pake dalam perancangan primer.
PerlPrimer
PerlPrimer merupakan software untuk mendesain secara mudah dan otomatis primer untuk standard PCR, bisulphite PCR, real-time PCR (QPCR) dan sekuensing, software yang yang dikembangkan dengan bahasa Perl dan Perl/TK untuk tampilannya sehingga bisa dijalankan di MacOSX, Linux dan Windows, saat ini versi terakhir dari PerlPrimer adalah 1.1.17. Kita bisa mendownload aplikasi ini secara bebas dan bisa merubah kode pemogramannya dikarenakan aplikasi ini berlisensi Free and OpenSource. Proses insatalasi PerlPrimer ini tergantung sistem operasi yang kita gunakan, PerlPrimer menyediakan paket instalasi untuk sistem operasi Mac, Linux dan Windows dengan proses intalasi yang tidak rumit, paket instalasi bisa di unduh disini.
Fitur-fitur PerlPrimer
- Menghitung kemungkinan primer dimmers yang terbentuk
- Mendownload langsung sekuen genom atau cDNA dari Ensembl
- Bisa langsung melakukan BLAST ke server NCBI atau serverl lokal
- Hasil dari desain perimer dapat di simpan, atau di eksport ke format tab-delimited sehingga bisa dibuka oleh aplikasi spreadsheet standar (OpenOffice, Microsoft Office). Informasi lebih detail mengenai PerlPrimer bisa merujuk ke http://perlprimer.sourceforge.net/methodology.html
Mendesain Primer untuk standard PCR dengan PerlPrimer
Untuk memulai mendesain primer untuk keperluan standard PCR, maka DNA tempalate yang akan di jadikan rujukan dalam desain bisa didapatkan langsung dari server database Ensmbl melalui PerlPrimer dengan mengklik ikon “Retrieve gene from Ensembl” atau dari menu file. Sebagai contoh, jika kita akan mencari gene pgr pada manusia, maka ketik “pgr” sebagai gene name dan pilih “Homo Sapiens” sebagai organism. Dan pastikan kita memilih “cdna” sebagai retrieval type, selanjutnya klik OK, maka setelah proses download selesai sekuens gen pgr akan tampil pada input box. Kita juga bisa secara langsung mengkopi sekuens DNA yang telah kita siapkan sebelumnya langsung di input area.
Setelah dna tempalte kita telah tersedia, maka selanjutnya menentukan strategi yang di inginkan, seperti berapa panjang primer yang akan kita desain. Untuk suhu annealing kita bisa mengatur di, begitu juga dengan GC, panjang amplikon yang dinginkan. setelah semua kondisi yang telah kita inginkan telah sesuai maka untuk mencari scara otomatis kandidat primer dengan mengklik find primer icon.
Tampilan PerlPrimer
Untuk melihat detail hasil proses pencarian kandidat primer dengan mengklik sekuen yang diinginkan.
detail kandidat oligo primer
untuk melakuan blast sequence primer yang kita inginkan dengan mengklik BLAST primer icon demikikan desain primer untuk PCR standard dengan perlPrimer.
Hasil BLAST
Selamat Mencoba,.
Tentu Anda sudah mengenal yang namanya DNA. DNA ini sering disebut-sebut terutama berkaitan dengan kriminalitas, diagnosa penyakit, penentuan ‘keabsahan’ keturunan, dll. Mungkin Anda bingung bagaimana caranya polisi bisa mengungkap pelaku kejahatan dengan berbekal sehelai rambut pelaku yang tercecer di TKP, atau dari tetesan sperma pemerkosa yang mengering di tubuh korban. Padahal kan sampel yang dianalisa jumlahnya sangat sedikit, ajaib!
Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction. Proses yang berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 µl ini mampu menggandakan atau mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula. Maka pantes aja dengan berbekal DNA yang terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai kebutuhan kita.
Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase.
PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Nah, sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali, dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup, 2 pangkat 30 alias 1.073.741.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu, kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi, tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.
Komponen PCR
Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:
Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.
dNTP (deoxynucleoside triphosphate)
dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.
Buffer
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.
Ion Logam
- Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.
- Ion logam monovalen, kalsium (K+).
Tahapan Reaksi
Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:
Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.
Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.
Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.
Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:
Pra-denaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).
Final Elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir
PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.
Aplikasi teknik PCR
Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:
Isolasi Gen
Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu apaan ya?
Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.
Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.
Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga [http://www.littletree.com.au/dna.htm]. Dan ajaib! Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi.
Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
DNA Sequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.
Forensik
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.
Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.
Diagnosa Penyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.
PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.
Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun setelah penemuannya (1993).
Sumber: Wikipedia, Andy Vierstraete dan sumber-sumber lainnya.
quantitative/realtime pcr presentationBerikut ini adalah materi presentasi mengenai dasar-dasar Quantitative PCR atau Real Time PCR dalam format PDF. Materi ini meliputi:
- Pendahuluan Quantitative PCR
- Metoda Deteksi
- Analisa Hasil
Untuk yang berminat bisa mendownload melalui link berikut ini:
- qPCR
- PCR & qPCR movie by Scanelis
Semoga bermanfaat.
