9 Tips untuk Real-Time PCR
Image from www.labnews.co.uk
Anda tentu mengenal Realtime PCR, ada hal-hal penting yang harus kita fahami dan lakukan untuk mendapatkan hasil yang dapat dipercaya dan konsisten. Apalagi kita tahu bahwa setiap reaksi realtime PCR memakan biaya yang tidak sedikit.
Dibanding teknik PCR konvensional (end-point PCR), realtime PCR memiliki berbagai keunggulan. Selain amplifikasi alias perbanyakan DNA fragmen yang dapat diamati seketika (secara realtime), dengan teknik ini kita pun dapat menentukan konsentrasi DNA yang terdapat pada sample. Maka tak heran jika teknik ini sering pula disebut Quantitative PCR (qPCR).
Bagaimana bisa amplifikasi diamati secara realtime? Kuncinya ada pada pewarna (dye) fluorescent (baik SYBR Green atau oligonucleotide terlabel fluorescent) yang dicampurkan ke dalam reaksi amplifikasi. Dye fluorescent ini (misal SYBR Green) bersifat dapat berpendar ketika ditembak oleh sinar laser (energi) jika terikat pada DNA utas ganda. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA hasil amplifikasi dapat diikuti secara realtime, semakin banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan. Sementara itu quantitative PCR dimungkinkan karena sensitifitas dye yang sangat tinggi, bahkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA hingga hitungan picogram (atau setara dengan sel tunggal saja!).
Sensitifitas yang tinggi seperti ini tentu saja rentan terhadap bias, sehingga perlu diperhatikan beberapa teknik berikut ini agar data yang diperoleh bisa konsisten dari waktu ke waktu dan selalu dapat diandalkan. Masalah yang sering muncul adalah adanya kontaminan dan ketidakkonsistenan hasil diantara ulangan.
Campur dengan Baik
Pembuatan mastermix adalah tahapan krusial dalam realtime PCR, sebab campuran pereaksi-pereaksi ini (dye, nukleotida, enzim, buffer, dll) selanjutnya akan dialiquot ke masing-masing tube/plate reaksi. Jika mastermixnya tidak homogen, maka jangan harap kita akan mendapatkan hasil yang konsisten.
Pastikan mastermix (baik yang fresh maupun yang telah disimpan di dalam freezer) telah tercampur dengan baik sebelum dialiquot, gunakanlah vortex.
Larutkan primer di dalam buffer
Seringkali kita melarutkan stok primer menggunakan air (ddH2O), padahal pH air bisa saja rendah (apalagi DEPC-treated ddH2O) yang bisa merusak DNA dalam waktu lama. Maka sebaiknya gunakan larutan buffer dengan pH netral untuk mencegah hidrolisis asam. Untuk mencegah aktifitas enzim DNase, bisa juga ditambahkan EDTA (1 mM) pada stok master primer, jangan takut EDTA akan menghambat aktifitas enzim Taq polymerase ketika PCR berlangsung karena konsentrasinya akan menjadi sangat kecil setelah dicampur menjadi mastermix/premix.
Biasakan untuk mengaliquot primer
Satu aturan yang harus ditaati dalam lab bioteknologi molekuler adalah sebisa mungkin hindarilah freeze/thawing, karena bisa mengundang kontaminan dan menyebabkan rusaknya primer. Maka jika kita mempunyai stok master primer (biasanya 100 uM), encerkanlah pada konsentrasi kerjanya (10 – 20 uM) menggunakan buffer netral dan buatlah aliquot. Usahakan agar primer tidak di-freeze-thaw lebih dari 5 kali.
Selain menghindari freeze-thaw berulang-ulang, peng-aliquot-an ini juga memudahkan kita saat terjadi kontaminasi, karena jika salah satu tabung primer terkontaminasi, kita masih memiliki stok primer lain yang masih bersih.
Gunakan pipet terkalibrasi dan ekslusif
Akurasi volume penambahan pereaksi seringkali menjadi masalah terutama jika volume yang ditambahkan sangat kecil. Untuk itu gunakan pipet sesuai jangkauan volumenya, gunakan teknik pemipetan yang baik dan pastikan pipet selalu dikalibrasi secara rutin.
Perlu disadari pula bahwa penggunaan pipet yang sama untuk berbagai keperluan merupakan sumber utama kontaminasi. Jangan gunakan pipet yang dipakai untuk ekstraksi DNA atau loading elektroforesis pada proses pembuatan mastermix realtime PCR, walaupun tips yang digunakan adalah tips aerosol resistant. Belilah satu set lengkap pipet yang didedikasikan khusus untuk pembuatan campuran pereaksi PCR, jangan dipakai untuk keperluan lain.
Buat kurva standar untuk setiap pasang primer baru
Setiap kali pesanan primer baru datang, buatlah sebuah kurva standar untuk menguji efisiensi reaksinya. Jangan mengasumsikan bahwa efisiensinya sama dengan primer yang sebelumnya digunakan, karena beda produksi bisa beda pula hasilnya.
Buatlah kurva standar 5 titik dengan jarak antar titik adalah 10 kali pengenceran. Pastikan bahwa kita dapat memperoleh efisiensi minimal 90% dengan menggunakan kontrol DNA.
Sediakan ruangan terpisah
Seperti halnya pipet, ruangan pun harus dibuat ekslusif dan terpisah, idealnya 3 ruangan, ruang ekstraksi DNA/RNA, ruang pembuatan campuran pereaksi (plus laminar air flow hood dengan sinar UV), serta ruang penambahan template DNA/RNA dan mesin realtime PCR itu sendiri. Dengan adanya pemisahan ruang dengan baik diharapkan tidak terjadi reaksi amplifikasi pada kontrol negatif akibat kontaminasi.
Cek ulang program siklus PCR
Cek ulang apakah kondisi siklus PCR sudah diprogram dengan benar sebelum reaksi PCR dimulai. Ini terutama wajib dilakukan jika mesin realtime PCR tersebut digunakan secara bersama-sama, karena ada kemungkinan program siklus PCR yang sudah kita simpan diubah oleh seseorang tanpa sepengetahuan kita. Tak ada salahnya kita mengecek ulang dari pada pada akhirnya reaksi amplifikasi kita gagal total.
Encerkan template
Realtime PCR jauh lebih sensitif dibanding PCR konvensional, jadi jangan samakan penambahan template untuk realtime PCR dengan PCR konvensional. Malahan seringkali jumlah template yang sedikit/encer memberikan hasil pengukuran yang lebih akurat. Di samping itu pengenceran dapat mengurangi efek kontaminan inhibitor yang mungkin terbawa saat isolasi DNA/RNA, karena ikut terencerkan maka efeknya terhadap akurasi sampel pun dapat ditekan.
Idealnya kurva sampel melintasi garis threshold antara siklus 20-30, ini dapat dicapai dengan mengatur konsentrasi sampel. Untuk sampel-sampel baru, kita bisa membuat dulu kurva kalibrasi (minimal 3 seri pengenceran standar) untuk melihat pada pengenceran sampel berapakah yang memberikan Ct (cycle threshold) yang berada di dalam kurva sehingga hasilnya akan akurat.
Buatlah larutan pengenceran fresh
Konsentrasi larutan asam nukleat (DNA/RNA) jika disimpan pada tabung plastik makin lama akan semakin berkurang. Ini karena asam nukleat dapat menempel pada dinding tabung. Oleh karena itu gunakan selalu serial pengenceran yang baru/fresh. Jika terpaksa harus menyimpannya untuk keperluan pengukuran berikutnya, maka gunakan Pelindung seperti carrier nucleid acid seperti tRNA, atau menggunakan tabung yang telah diberi perlakuan silikon atau dengan menggunakan tabung yang tidak mengikat DNA/RNA. Jangan lupa pula untuk mengukur kembali konsentrasinya sebelum digunakan untuk memastikan bahwa konsentrasinya tidak berubah.
Tips-tips di atas sangat penting diperhatikan terutama bagi para peneliti yang baru memulai penggunaan metode realtime PCR, karena langkah-langkah kecil seperti di atas sangat menentukan kekonsistenan dan tingkat kepercayaan hasil analisa kita.
Bagi Anda yang sudah terbiasa menggunakan realtime PCR, sangat kami tunggu urun-rembugnya jika ada hal-hal lain yang perlu diperhatikan selain yang telah kami uraikan. Bagian komentar di bawah ini dapat mewadahi kita untuk berdiskusi lebih lanjut.
Sumber: BiteSizeBio
