Archive for: rna
DNA membawa 'Resep Kehidupan' (image from virtualmedicalcentre.com)
Kode genetik mungkin merupakan sandi tertua di dunia. Ia sudah ada sejak makhluk hidup pertama diciptakan. Sandi ini terdapat pada DNA yang terdapat pada setiap makhluk hidup, berupa urutan 3 huruf yang mengkodekan asam amino penyusun protein. Yang membuat kita terkagum-kagum, sandi ini nyaris sama di setiap makhluk hidup. Kode DNA pada manusia sama artinya dengan kode pada binatang, tanaman, jamur, bakteri bahkan virus (tentu saja Ada sedikit pengecualian tetapi tidak signifikan). +Continue Reading
Istilah pencarian terpopuler untuk artikel ini:
Mana yang lebih baik untuk melarutkan DNA/RNA? TE Buffer atau ddH2O? Pertanyaan ini seringkali muncul dan menjadi bahan diskusi yang menarik. Dan ternyata masing-masing memiliki kelebihan dan kelemahan sehingga pelarut mana yang dipilih amat bergantung pada tujuan kita melarutkan DNA/RNA.
DNA Precipitate | Image from http://www.biotechlearn.org.nz/
TE Buffer
TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. Berikut ini resep pembuatannya:
Larutan Tris-HCl 1 M pH 7.5
Untuk membuat 1 L larutan:
- Tambahkan 121.14 g Tris Base (BM = 121.14 g/mol) ke dalam 800 mL ddH2O
- Atur pH hingga mencapai pH 8.0 dengan larutan HCl 4N
- Tambahkan ddH2O hingga volumenya tepat 1 L
Catatan: Nama kimia dan nama lain dari Tris base adalah 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol, THAM, Tris(hydroxymethyl)aminomethane, atau Trometamol
Larutan EDTA 500 mM pH 8.0
Untuk membuat 1 L larutan:
- Tambahkan 186,12 g Sodium EDTA dihydrate (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) atau 146.12 g EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) ke dalam 800 mL ddH2O
- Atur pH hingga mencapai pH 8.0 dengan larutan NaOH 4 N
- Tambahkan ddH2O hingga volumenya tepat 1 L
Untuk membuat 1 L larutan Stok TE Buffer 10X, campurkan larutan-larutan berikut ini:
- 100 ml Tris-HCl 1 M pH 7.5
- 20 ml EDTA 500 mM pH 8.0
- 880 ml ddH2O
Larutan diaduk hingga bercampur sempurna.
Larutan TE Buffer dapat disterilkan menggunakan autoclave.
ddH2O
ddH2O atau disebut juga aqua bidestillata atau ultrapure water, adalah air yang sangat murni, lebih murni dari aquadest atau pun air reverse osmosis karena telah melalui berbagai macam cara pemurnian. Pada awalnya orang melakukan destilasi kembali pada air yang telah didestilasi, namun saat ini digunakan kombinasi berbagai jenis pemurnian untuk memperoleh ultrapure water ini (Artikel tentang tingkat kemurnian air dapat dilihat selengkapnya di sini).
Secara umum ddH2O dibuat dengan melewatkan aquadest ke dalam suatu cartridge berisi resin-resin filter dan deionisasi untuk menghilangkan ion-ion dari air, hingga diperoleh nilai hantaran listrik yang sangat kecil (sekitar 5.5 × 10−6 S·m−1 atau 18 MΩ cm), terakhir air tersebut dilewatkan melalui filter membran dengan pori-pori 0.22 µl. Biasanya ddH2O tidak perlu disterilkan lagi menggunakan autoclave.
Mana yang Lebih Baik?
Kedua pelarut di atas paling umum digunakan untuk melarutkan DNA atau RNA, karena keduanya dapat melarutkan DNA atau RNA dengan baik. Namun untuk alasan stabilitas dan tujuan pemakaian DNA atau RNA, maka keduanya memiliki keunggulan dan kelemahan masing-masing.
DNA atau RNA akan lebih stabil jika dilarutkan dalam TE buffer karena pH-nya djaga sekitar 8. Ingat bahwa fungsi utama buffer adalah menyangga pH pada nilai tertentu. Jika dilarutkan dalam ddH2O, ada peluang untuk berubahnya pH. Ini dapat terjadi karena DNA dan RNA memiliki sifat asam lemah (ingat: DNA=asam deoksiribonukleat, RNA=asam ribonukleat), yang dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi DNA/RNA, apalagi DNase juga bekerja pada pH yang sedikit asam. Jadi untuk alasan kestabilan, buffer TE lebih unggul dibanding ddH2O.
Meskipun TE buffer membuat stabil DNA, tapi kita harus berhati-hati jika DNA atau RNA tersebut akan digunakan untuk aplikasi enzimatis seperti PCR (Polymerase Chain Reaction). Kenapa begitu? Karena TE buffer mengandung EDTA, yang dapat membentuk senyawaan kompleks dengan ion logam seperti Mg2+. Dalam hal ini EDTA merupakan chelating agent. Padahal Mg2+ adalah prekursor untuk enzim Taq DNA polymerase yang digunakan pada reaksi PCR, jadi kalau jumlah EDTA pada larutan DNA atau RNA cukup banyak, bisa menyebabkan reaksi PCR menjadi terhambat karena enzim DNA polymerase-nya tidak dapat bekerja secara sempurna. Jadi utk alasan ini, ddH2O lebih unggul dibanding TE buffer karena ddH2O tidak mengandung chelating agent.
Jadi, aplikasi lanjutan dari sampel DNA atau RNA akan menentukan pilihan kita. Jika DNA atau RNA akan segera digunakan untuk aplikasi PCR, lebih baik menggunakan ddH2O sebagai pelarut. Jika bukan dan akan disimpan dalam waktu yang cukup lama, TE buffer lah pilihannya. Tapi bisa saja kita mengakalinya dengan mengganti TE buffer dengan Tris-HCl buffer pH 8 karena tidak mengandung EDTA. Larutan Tris-HCl buffer ini sering digunakan sebagai elution buffer pada kit-kit purifikasi DNA/RNA komersial.
Satu hal lagi yang harus diingat, TE buffer atau ddH2O yang digunakan untuk melarutkan RNA harus bebas RNase, yaitu yang sudah di-treatment dengan DEPC (Diethyl Pyrocarbonate).
Selain itu, faktor penyimpanan juga sangat berpengaruh terhadap kestabilan larutan DNA atau RNA. Hal-hal berikut harus diperhatikan:
- Simpanlah larutan DNA atau RNA pada suhu -20oC atau -80oC (untuk RNA)
- Jangan sering-sering melakukan freeze-thaw, lebih baik melakukan aliquot dengan membagi larutan DNA atau RNA ke dalam beberapa tabung dengan volume lebih kecil.
So, apakah ada argumen lain yang bisa diungkapkan? Silakan tinggalkan komentar untuk kami.
Istilah pencarian terpopuler untuk artikel ini:
RT PCR alias Reverse Transcriptase PCR adalah teknik yang digunakan untuk membuat cDNA (complementary DNA) dengan RNA sebagai template-nya. Proses ini adalah kebalikan dari transkripsi DNA menjadi RNA yang umum terjadi pada makhluk hidup, sehingga dinamakan reverse transcription (transkripsi terbalik). Di alam proses ini hanya terjadi pada virus-virus tertentu ketika menyusupkan materi genetiknya yang berupa RNA ke dalam genom ‘korbannya’. (Lihat kembali mengenai ‘Central Dogma in Molecular Biology‘).
HIV, salah satu virus yang memiliki enzim Reverse Transcriptase | Image from www.vircolab.com
Catatan: Jangan keliru dengan istilah realtime PCR yang juga sering disingkat RT PCR. Yang kita bahas di sini adalah Reverse Transcriptase PCR. Untuk membedakan biasanya istilah realtime PCR diganti dengan quantitative PCR (qPCR).
Di laboratorium, RT PCR umumnya dilakukan untuk menganalisa tingkat ekspresi genetik. Karena ekspresi setiap gen berbeda-beda, maka proses RT PCR harus dilakukan secara efisien dan tidak boleh melewatkan RNA dari gen yang tergolong ‘low copy’ dan sulit.
Berikut ini adalah beberapa tips yang mungkin dapat membantu:
Pemilihan primer RT
Ada 3 pilihan primer, oligo dT, random primer atau primer spesifik gen. Banyak orang menggunakan oligo dT karena mereka bisa mendapatkan salinan cDNA lengkap dari full mRNA.
Akan tetapi, jika mRNA-nya panjang (>4 kb) atau tidak memiliki ekor poly A (mRNA prokaryota), maka pilihannya adalah random primer. Dengan random primer, ujung 5′ gen-gen yang panjang dapat ditranskripsi balik, tetapi cDNA yang diperoleh mungkin tidak full dari seluruh gen. Biasanya digunakan random primer 6-mers, tetapi 8 atau 9-mers dapat meningkatkan ukuran cDNA karena primernya akan terhibridisasi lebih jarang.
Untuk aplikasi qPCR (quantitative PCR) gen-gen eukaryota, hasil terbaik bisa diperoleh dengan menggunakan kombinasi random primer panjang dan oligo dT.
Pilihan ketiga adalah primer spesifik gen yang dapat meningkatkan sensitivitas dengan mengarahkan seluruh aktifitas enzim RT untuk mentranskripsi balik hanya RNA tertentu saja. Jika yang kita lakukan adalah one-step RT PCR, primer spesifik gen digunakan karena primer RT juga nantinya digunakan sebagai primer reverse pada reaksi PCR-nya.
Struktur Sekunder RNA
Struktur sekunder ini bisa jadi masalah dalam transkripsi balik RNA secara utuh. Ibarat menemui jalan buntu, enzim RT dapat berhenti ketika menemui struktur sekunder pada RNA-nya.
Sulit memang memprediksi apakah RNA kita akan memiliki struktur sekunder, tapi biasanya kandungan GC yang tinggi bisa kita jadikan indikator bahwa RNA akan sulit untuk memisah dan mungkin tidak akan benar-benar menjadi utas tunggal sebelum reaksi. Untuk mengatasinya, bisa dengan melakukan denaturasi dulu pada suhu 65C selama 5 menit sebelum reaksi RT agar RNA-nya dalam keadaan rileks.
Pendekatan lainnya adalah dengan menggunakan enzim RT yang dapat bekerja pada suhu yang lebih tinggi dari RT standar. Ada juga enzim RT yang mampu menembus struktur sekunder RNA meski dilakukan pada suhu RT standar.
Menyingkirkan gDNA
Kontaminasi DNA genom (gDNA) pada RNA merupakan salah satu penyebab terjadinya false positif saat reaksi PCR nantinya. Ada beberapa cara untuk menyingkirkan gDNA, misalnya pemberian DNase selama proses atau setelah isolasi RNA.
Jika sample RNA diisolasi dari sel eukaryota, maka cara terbaik menghindari kontaminasi gDNA ketika PCR adalah dengan mendesain primer yang menyeberangi intron atau batas intron-exon. Seperti kita tahu bahwa mRNA pada eukaryota merupakan hasil transkripsi dari exon pada gDNA tanpa diseling-selingi lagi oleh intron-intron. Dengan cara ini tidak akan terjadi amplifikasi terhadap gDNA (atau setidaknya akan memiliki produk PCR yang berbeda ukurannya).
Satu hal yang harus diwaspadai adalah pseudogene, yaitu salinan dari mRNA hasil splicing yang diinsersikan ke dalam genom. Primer yang didesain hanya untuk mRNA tadi tetap akan mengamplifikasi pseudogene ini.
Untuk mRNA prokaryota masalah tidak akan selesai dengan primer yang didesain menyeberangi intron karena gDNA prokaryota tidak memiliki intron, sehingga penyingkiran gDNA ini amat krusial untuk keakuratan pengukuran ekspresi gen. Satu-satunya pilihan adalah reaksi enzimatik selama proses isolasi mRNA seperti yang diuraikan di atas. Harus dipastikan pula bahwa gDNA benar-benar tidak mengganggu amplifikasi, misalnya dengan buffer-buffer tertentu penghilang sisa-sisa DNA atau dengan mengamplifikasi (PCR) langsung RNA hasil isolasi tanpa melalui proses RT PCR. Jika amplifikasi PCR tetap terjadi berarti gDNA masih bercokol di situ.
Memeriksa RNA Integrity
Kualitas RNA amat berpengaruh terhadap hasil sintesa cDNA. Variasi kualitas RNA dari batch-ke-batch dapat menyebabkan hasil yang tidak konsisten. Sebelum melakukan reaksi RT PCR, kita harus memeriksa kualitas band rRNA dengan melarikannya pada gel agarose dan memeriksanya secara visual. RNA eukaryota yang masih utuh (intact) ditunjukkan dengan adanya dua band rRNA 28s dan 18s yang jelas dengan intensitas pita 28s (lebih besar) kira-kira 2 kali intensitas pita 18s (lebih kecil). Jika intensitasnya sama pun masih bisa dianggap bagus.
Jangan gunakan RNA yang memiliki smear tebal di sekitar pita rRNA apalagi pada bagian bawah untuk reaksi RT PCR. Karena jika demikian sample RNA tersebut telah terdegradasi.
Cara yang lebih akurat dan hemat sample adalah menggunakan Agilent BioAnalyzer untuk menentukan kualitas RNA secara lebih akurat. Selain menampilkan visualisasi pita-pita RNA dalam bentuk grafik, juga dapat menghitung RNA Integrity Number (RIN) secara kuantitatif. Skor RIN sempurna adalah 10, RIN 8 tetap OK, dan jika sudah di bawah 7 maka artinya sample RNA kita sudah terdegradasi dan akan menyebabkan hasil yang tidak konsisten. Cara ini memang lebih mahal tetapi hasil yang diberikan sangat akurat, terlebih jika sample RNA akan digunakan untuk analisa ekspresi seperti microarrays.
Pengukuran Kuantitas RNA
Selain keutuhan RNA, kuantitas hasil isolasi RNA pun penting untuk diketahui. Akurasi hasil pengukuran dapat dipengaruhi beberapa faktor seperti akurasi instrumen yang digunakan, kontaminasi DNA, garam-garam, dan juga tingkat degradasi RNA. Untuk pengukuran kuantitas RNA, spektrofotometer Nanodrop adalah alat yang digemari karena kemudahan dan akurasinya, disamping itu jumlah sampel yang diperlukan hanya 1 uL saja sehingga sangat menghemat sampel RNA yang sangat berharga untuk penelitian selanjutnya.
Kelemahan instrumen spektrofotometer UV untuk pengukuran RNA adalah bahwa DNA genom dan garam-garam yang mengkontaminasi akan terukur juga absorbansinya bersama dengan RNA sehingga akan menyebabkan false positive. Untuk itu dikembangkan suatu teknik pewarnaan spesifik RNA menggunakan Ribogreen, jadi yang diukur absorbansinya adalah Ribogreen yang terikat pada RNA sehingga hasil pengukuran akan lebih akurat.
One Step RT-PCR atau Two Step RT-PCR?
Pada one step RT-PCR, reaksi transkripsi balik untuk mengkonversi RNA menjadi cDNA dan reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen tertentu yang ingin kita ketahui ekspresinya dilakukan dalam satu rangkaian reaksi dan dalam satu tabung reaksi yang sama. Sedangkan pada two step RT-PCR, reaksi transkripsi balik dan reaksi PCR dilakukan secara terpisah dan melibatkan beberapa tabung reaksi.
Masing-masing cara memiliki keunggulan dan kelemahan, dan pilihannya amat bergantung pada penelitian yang kita lakukan. Dengan one step RT-PCR, tidak ada proses transfer sample sehingga mengurangi sumber kontaminasi, dan karena digunakan primer spesifik untuk RT-PCR dan PCR, maka sensitifitasnya bisa lebih baik. Dengan two step RT-PCR, RNA dapat dikonversi menjadi cDNA dalam jumlah besar sekaligus, baru kemudian dialiquot untuk digunakan pada analisis beberapa gen berbeda. Ini dapat mengurangi variasi ketika membandingkan ekspresi beberapa gen dari sumber yang sama. Pilihan primer pun beragam, bisa oligo dT, random primer atau primer spesifik gen. Jadi, pilihannya bergantung kebutuhan riset kita.
Karena banyak faktor yang mempengaruhi kesuksesannya, maka alangkah baiknya kita merancang metode RT-PCR ini dengan lebih baik, dan kondisi yang optimum bisa saja bervariasi dari satu penelitian ke penelitian lainnya. Dan begitu kondisi yang optimum sudah diperoleh, maka metode tersebut dapat digunakan secara konsisten.
Istilah pencarian terpopuler untuk artikel ini:
Ribosom (Image from media.photobucket.com)
Kita mungkin tak sadar kalau tubuh kita adalah sebuah mesin super canggih yang belum bisa ditandingi oleh mesin manapun. Ya, mesin ini terdiri dari mesin-mesin mikro yang sangat banyak. Ia mampu memproduksi sesuatu yang menopang hidup kita sendiri, berjalan dengan sangat efektif, sangat efisien, terintegrasi satu sama lain, mampu membedakan apa yang harus diproduksi dan apa yang tidak, tahu kapan harus bekerja dan kapan beristirahat, ada sistem pengendalian mutu (quality control) dan jaminan mutu (quality assurance), benar-benar canggih.
Mesin itu jumlahnya amat banyak, ada di dalam setiap sel tubuh kita. Mereka memproduksi zat yang super penting yaitu protein, dengan DNA sebagai buku resepnya (blueprint ). Protein inilah yang sesungguhnya menjalankan banyak sekali fungsi kehidupan. Melalui protein lah gen-gen dalam tubuh kita menentukan hampir segala sesuatu tentang tubuh kita, misalnya apa warna rambut kita, bagaimana kita memproses makanan dalam tubuh atau seberapa tahan kita terhadap suatu penyakit. Jadi terbayang kan betapa canggihnya mesin dalam tubuh kita?
Sekilas Protein
Protein adalah molekul yang sangat besar dan kompleks, ia berupa polimer yang tersusun atas rantai panjang molekul-molekul subunit yang dinamakan “asam amino”. Ada 20 jenis asam amino yang menyusun protein, struktur dasar semuanya sama, tapi rantai samping (gugus R) yang berbeda-beda membuat sifat kimiawinya berbeda pula.
Struktur Molekul Asam Amino (Image from en.wikipedia.org)
Seperti umumnya polimer lain seperti DNA, asam-asam amino tersusun rapi bak anak tasbih berjejer membentuk tasbih. Asam-asam amino tersusun satu per satu membentuk rantai lurus protein dengan keteraturan tertentu. Namun yang unik dari protein ini adalah bentuk tiga dimensinya yang tidak lurus seperti tali, melainkan berlipat-lipat, berpelintir, membentuk sebuah struktur tertentu yang khas, berbeda satu sama lain. Bahkan struktur tiga dimensi inilah yang membuat protein dapat berfungsi. Kesalahan sedikit saja protein ini melipat, maka bisa menyebabkan malfungsi bahkan penyakit-penyakit yang sulit disembuhkan.
Struktur Protein (Image from en.wikipedia.org)
Contoh kesalahan struktur tiga dimensi ini misalnya pada penyakit Cystic Fibrosis. Penyakit ini diakibatkan sebuah protein bernama CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) yang gagal melipat dengan benar. Penyebabnya ‘sepele’ saja, ‘hanya’ karena ada satu asam amino penyusun CFTR yang kurang (terdelesi). Namun efek tidak berfungsinya CFTR membuat ion khlorida tidak dapat melewati outer membrane pada sel, sehingga menyebabkan terbentuknya lapisan mukus yang tebal di paru-paru dan organ-organ pencernaan. Akibatnya cukup fatal karena dapat menyebabkan kematian penderitanya di usia belia. ‘Hanya’ gara-gara kurang satu asam amino.
Hingga saat ini, para ilmuwan belum dapat memprediksi struktur tiga dimensi (3D) suatu protein dengan tepat. Yang bisa dilakukan adalah mengamati struktur tiga dimensi melalui pengamatan difraksi sinar X. Prediksi baru bisa dilakukan hingga struktur sekunder saja, yaitu apakah suatu bagian tertentu protein membentuk spiral ‘alfa helix’ atau lembaran ‘beta sheets’, sedangkan struktur tersier (3D) masih ‘samar-samar’. Padahal kalau kita dapat memprediksi struktur 3D, kita dapat mengerti atau memprediksi sifat fetonip suatu organisme.
Implikasi lain jika struktur 3D protein mampu diprediksi adalah bagi dunia medis. Dengan mampunya kita memprediksi bagaimana protein melipat di dalam sel, maka secara teoritis kita dapat merancang obat yang tepat yang dapat menghambat fungsinya melalui program komputer tanpa harus ‘bersusah payah’ dan mengeluarkan biaya besar untuk eksperimen. Kita berharap semoga para ahli structural bioinformatics mampu segera menyelesaikan masalah ini.
Bagaimana Protein Diproduksi dalam Tubuh?
Ada tiga tahap proses yang terlibat dalam produksi protein. Semuanya terjadi dengan cara yang cerdas, efektif, efisien dan super canggih. Yo kita lihat.
Replikasi DNA
Replikasi adalah proses penggandaan DNA ketika suatu sel membelah dan membentuk sel yang baru. DNA pada sel lama berfungsi sebagai cetakan (template) untuk membuat salinan DNA pada sel baru yang urutan basa A-C-G-T nya persis sama. Ini menjamin setiap sel dalam tubuh kita memiliki seperangkat resep lengkap untuk membuat protein yang dibutuhkan.
DNA Replication (Image from www.coolschool.ca)
Transkripsi
Pada tahap awal produksi protein, informasi resep yang ada pada gen dikopi satu per satu (basa per basa) dari sebuah rantai DNA di dalam nukleus sel menjadi rantai RNA pembawa pesan (messenger RNA = mRNA). Rantai DNA berfungsi sebagai cetakan (template) yang akan menghasilkan mRNA komplemennya. Bedanya, basa T (thymine) pada DNA digantikan oleh U (uracil) pada mRNA, namun keduanya tetap sama-sama berkomplemen dengan A (adenine). Proses pengkopian DNA menjadi RNA ini dinamakan transkripsi.
Transcription (Image from en.wikipedia.org)
Perlu diingat bahwa jumlah mRNA yang ditranskripsi diatur (diregulasi) oleh tubuh kita sendiri, setiap sel hanya mentranskrip gen-gen yang dibutuhkan. Sel rambut hanya mentranskrip gen-gen pengkode protein di rambut saja, begitu pula dengan sel jantung, kulit, darah, dll. Dalam transkripsi dikenal juga istilah gen yang on dan off, on artinya gen tersebut ditranskripsi menjadi mRNA, off berarti sebaliknya. Jumlah mRNA yang disintesis pun tidak sembarangan, sedikit banyaknya disesuaikan dengan kebutuhan.
Translasi
mRNA hasil transkripsi kemudian dikeluarkan menuju sitoplasma sehingga bisa diproses lebih lanjut oleh suatu organel sel yang bernama ribosom. Ribosom akan membaca urutan basa RNA dan menterjemahkannya (translate ) menjadi urutan asam amino tertentu sesuai dengan resep yang dibawa mRNA. Di sinilah asam-asam amino itu dirakit sesuai urutan yang diresepkan gen (DNA) dan kemudian melipat membentuk struktur tiga dimensi yang fungsional.
Protein Translation (Image from www.scq.ubc.ca)
Anda dapat melihat video proses Replikasi, Transkripsi dan Translasi di sini.
Central Dogma
Tiga langkah proses di atas dinamakan “Central Dogma” dan bisa dikatakan sebagai tulang punggung Biologi Molekular. Ini semua sudah direncanakan alam dan masing-masing ada kegunaannya sendiri-sendiri.
Central Dogma of Molecular Biology (Image from en.wikipedia.org)
Coba perhatikan ketiga proses di atas, replikasi menjamin resep tubuh kita (DNA) tetap terjaga utuh di setiap sel. Transkripsi melibatkan RNA pembawa pesan (mRNA) yang mana sekaligus melindungi “otak” seluruh sistem ini –yaitu DNA– dari kerusakan, mengingat sintesis protein terjadi di sitoplasma yang penuh dengan bahan-bahan kimia, maka kalaupun terjadi kerusakan pada mRNA, DNA sebagai resep utama masih tetap utuh terjaga. Akhirnya, mRNA hasil transkripsi diterjemahkan (translasi) menjadi protein sebagai ‘pekerja’ bagi tubuh kita. Protein yang disintesis terkait langsung dengan regulasi ketika transkripsi, jadi protein apa saja yang disintesis dan berapa jumlahnya amat sangat teratur, tidak boleh ada istilah kekurangan atau kelebihan.
Tiga langkah yang terlihat sederhana, simple namun ternyata amat rumit dan canggih dan menghasilkan sesuatu yang luar biasa bergunanya bagi kehidupan. Ya, semuanya ada dalam tubuh kita sendiri.
Istilah pencarian terpopuler untuk artikel ini:
Gel Electrophoresis; image from http://clearlyexplained.com/culture/health/electrophoresisgel.jpg
Saat ini, teknik pemisahan dan pemurnian DNA/RNA merupakan teknik yang tidak dapat dipisahkan dari biologi molekular. Hampir semua penelitian DNA/RNA mesti melibatkan pemisahan dan pemurnian yang tekniknya cukup beragam. Elektroforesis adalah salah satu teknik pemisahan paling populer, maka tak heran jika elektroforesis disebut sebagai pintu gerbang dari berbagai penelitian biologi molekular. Nah, sekarang ada baiknya kita telusuri dulu teknik-teknik tersebut dari masa ke masa.
Oh ya, pada prinsipnya elektroforesis itu adalah teknik pemisahan campuran molekul yang didasarkan pada perbedaan muatan listriknya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fasa diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda.
Elektroforesis dengan Kertas Saring
Smithies menerima hadiah Nobel
Smithies menerima hadiah Nobel
Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Bagaimana keduanya bisa mengungkap rahasia ini?
Paper Electrophoresis. Image from www.funsci.com
Paper Electrophoresis. Image from www.funsci.com
Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu mereka namakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.
Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, mereka dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.
Elektroforesis Gel Kanji
Starch Gel Electrophoresis. Image from http://www.terrapub.co.jp
Starch Gel Electrophoresis. Image from http://www.terrapub.co.jp
Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu.
Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida. Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.
Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE)
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Image from www.siumed.edu
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Image from www.siumed.edu
Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar.
Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.
Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Skema Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Skema Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor membeberkan ide cerdasnya untuk memisahkan campuran DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada patogen.
Keempat teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian lainnya dalam bidang biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit dibayangkan sebuah laboratorium biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA yang sedang kita teliti akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan, sulit pula membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis selain dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun sangat bergantung pada teknik elektroforesis ini. Terima kasih kepada Markham dan Smith yang telah mencoba meneteskan RNA hidrolisat pada selembar kertas saring dan memisahkannya dengan arus listrik.
Sumber:
- Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group.
- http://dukeresearch.blogspot.com/2009/04/flipping-through-chronicles-of-nobel.html
Istilah pencarian terpopuler untuk artikel ini:
