Tips & Trik untuk SDS PAGE

Tidak seperti elektroforesis agarose yang persiapannya cukup sederhana, banyak peneliti menemukan masalah saat akan melakukan persiapan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Bahan yang berbahaya, proses pembuatan yang memakan waktu, sampai berbagai macam resiko seperti kebocoran dan gel yang tidak membeku menyebabkan SDS-PAGE sering dikatakan ‘merepotkan’. Beberapa cukup beruntung dapat menggunakan gel pre-set namun masih banyak dari kita yang harus menyiapkan dari nol. Di website ini telah dibahas cara mencegah kebocoran SDS-PAGE dan kali ini akan dipaparkan tips dan trik dalam menjalankan SDS-PAGE untuk meminimalisir kesalahan dan meningkatkan kualitas hasil yang didapat.

Mencegah efek batas (edge effects)

Pada umumnya sampel yang dimuat ke sumur paling ujung akan bergerak dalam kecepatan yang berbeda dari sumur yang lain. Hal ini dikenal sebagai edge effect. Untuk mencegah terjadi edge effect, disarankan untuk memprioritaskan pengisian di sumur-sumur tengah dan membiarkan sumur paling ujung kosong. Untuk meminimalisir edge effect, sumur yang tidak digunakan dapat diisi sample dye 1x.

Pengaruh temperatur

• Pembuatan gel sebaiknya dilakukan di suhu ruang karena akrilamid membeku lebih lambat pada suhu rendah. Untuk mendapatkan gel penahan dengan polimerisasi yang seragam juga dapat dilakukan dengan pemanasan menggunakan hair dryer setelah gel dituang ke dalam plate
• Apabila akan menjalankan elektroforesis di suhu rendah, sebaiknya mengganti SDS dengan lithium dodesil sulfat (LiDS) karena LiDS tidak mengendap pada suhu dingin.

Analisa sekuen protein

• Apabila hasil SDS-PAGE akan dilanjutkan untuk renaturasi atau pengerjaan sekuen protein, gel sebaiknya dibiarkan selama 5 jam setelah proses polimerisasi untuk membiarkan TEMED dan amonium persulfat berinteraksi sempurna dengan gel untuk menghindari interaksi kedua senyawa dengan ujung amino dari peptida
• Tambahkan 0.1 mM asam thioglikosilat pada gel penahan apabila sampel protein akan dilanjutkan untuk pengerjaan sekuen

Persiapan sampel

• Untuk resolusi optimal, vorteks sampel protein sebelum dan sesudah pemanasan
• Apabila sampel terlalu encer, tambahkan asam trikloroasetat (TCA) 10% (w/v) dan inkubasi selama 5 menit pada suhu 4^oC. Sentrifugasi dan cuci pelet dengan aseton dingin. Pelet diresuspensi sampai volume yang diinginkan. Cara ini juga efektif untuk menurunkan kandungan garam di sampel
• Sentrifugasi sampel pada 12.000 g selama 2-5 menit sebelum dimuat ke sumur untuk menghilangkan agregat
• Sebaiknya selalu periksa konsentrasi protein di sampel. Sumur pada mini-gel tidak bisa memuat lebih dari 150 mikrogram protein termasuk protein kompleks sekalipun
• Sampel yang telah disiapkan (dipanaskan dalam buffer sampel) dapat dimuat dalam aliquot dan disimpan pada suhu -20^oC untuk 3-4 minggu atau 4^oC untuk seminggu. Perlu diperhatikan, proses freezing-thawing yang berulang-ulang dapat menyebabkan degradasi protein. Sebelum menggunakan sampel yang disimpan seperti ini diperlukan pemanasan pada 37^oC dalam beberapa menit untuk melarutkan endapan

Memudahkan proses loading

Loading atau memuat sampel dalam sumur elektroforesis bisa menjadi hal yang sangat merepotkan karena sumur terkadang sulit ditemukan. Penggunaan gel pre-set dapat menghilangkan masalah ini namun biasanya kita menggunakan penanda sumur yang diletakkan di atas chamber. Masalahnya adalah penanda sumur terkadang kurang akurat dan dapat bergeser.

Untuk membantu proses loading dapat ditambahkan bromofenol blue pada gel penahan. Bromofenol blue adalah senyawa pada buffer sampel sehingga tidak akan mengganggu proses elektroforesis. Cukup tambahkan sekitar 0.003% pada master mix atau bisa juga pewarna ditambahkan pada buffer gel penahan sampai konsentrasi akhir 0.0012%.

Demikian beberapa tips & trik yang dapat kami berikan. Anda memiliki tips & trik lain? Silakan disampaikan melalui kolom komentar di bawah ini.

Other articles you may like:

• Troubleshooting pada SDS-PAGE (Bagian 2)
• Troubleshooting pada SDS-PAGE (Bagian 1)
• Trik Mengatasi Kebocoran Gel SDS-PAGE
• Troubleshooting pada SDS-PAGE (Bagian 3 – Habis)
• Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi Molekular
• 9 Tips untuk Real-Time PCR
• Pewarnaan Gel dengan SYBR Green

Tags: buffer electrophoresis elektroforesis protein sds page