Archive for the ‘BioLaboratory’ Category
Multichannel Pipet (Image from ic.daad.de)
Bekerja di laboratorium tentu tidak akan terlepas dari urusan ukur-mengukur. Untuk sampel padatan, kita akan berurusan dengan neraca analitik, sementara untuk sampel cairan, pipet volumetrik-lah andalannya. Akurasi dan presisi pemipetan merupakan faktor utama keberhasilan analisa atau percobaan yang melibatkan cairan. Pipet sudah digunakan sejak abad ke-19 oleh Louis Pasteur (1822-1895) dan kini jenis pipet sudah berkembang luas dengan tingkat akurasi dan presisi yang bermacam-macam pula. +Continue Reading
DNA atau Deoxyribonucleic Acid yang merupakan sandi genetik makhluk hidup ternyata dapat dijadikan bahan ‘permainan’ gunting dan tempel. Ya, ini serius lho. Para ahli rekayasa genetika kerapkali melakukan ‘permainan’ ini untuk memperoleh susunan DNA yang diinginkan dan memiliki fungsi tertentu. Istilah kerennya Rekayasa Genetika.
Contoh paling terkenal adalah yang terjadi pada gen insulin dari pankreas manusia yang dengan ‘permainan’ ini dapat dimasukkan ke dalam sel bakteri –seperti E. coli– atau tumbuhan –seperti safflower– dan diekspresikan di dalamnya sehingga saat ini kita dapat memperoleh insulin (obat diabetes) tanpa harus mengekstraknya langsung dari sapi atau babi, cukup dengan menumbuhkan bakteri atau tanaman hasil rekayasa genetika yang memiliki gen insulin dan memanen insulin darinya.
Bagaimana ‘permainan’ ini dilakukan?
DNA ligase memperbaiki kerusakan kromosom. (Image from wikipedia.org)
Kita harus berterima kasih kepada para bakteri dan archaea karena umumnya mereka memiliki ‘gunting’ berupa enzim yang dapat memotong-motong DNA secara spesifik. Enzim ini berguna sebagai bentuk pertahanan bakteri terhadap DNA-DNA asing yang masuk ke dalam sel bakteri. DNA asing ini akan dipotong-potong agar tidak akan membahayakan bakteri lagi oleh enzim yang disebut ‘Restriction Endonuclease‘ (sering disebut enzim restriksi). DNA si bakteri sendiri sudah terlindungi dengan mekanisme tertentu (metilasi) sehingga akan terhindar dari pemotongan. Suatu sistem pertahanan yang sangat cerdas untuk makhluk sekelas bakteri.
Sedangkan ‘lem’ DNA secara alami terdapat baik pada eukaryota maupun prokaryota. Secara komersial, enzim ini diperoleh dari virus tertentu seperti bakteriofage T4 yang memiliki enzim ligase yang dapat menyambungkan gugus -OH pada suatu utas DNA dengan gugus -PO4 pada utas lainnya membentuk ikatan phosphodiester. Enzim ini pada dasarnya berfungsi untuk memperbaiki kerusakan-kerusakan pada kromosom.
Nah, para ilmuwan rekayasa genetika telah berhasil mengisolasi ratusan jenis ‘gunting’ untuk memotong-motong DNA dan ‘lem’ DNA untuk menyambungkan kembali hasil potongan tersebut sehingga diperoleh DNA dengan susunan tertentu.
Restriction Endonuclease
DNA tersusun atas empat basa nukleotoda yaitu A (adenine), G (guanine), C (cytosine) dan T (thymine). –Lihat kembali artikel tentang DNA di sini. Enzim restriksi (dalam hal ini adalah Restriction Endonuclease Type II) alias ‘gunting’ DNA hanya akan memotong DNA pada tempat tertentu saja, yaitu jika ia menemukan susunan palindrom, urutan basa yang jika dibaca dari kedua utas DNA akan tetap sama. Perhatikan contoh sekuen berikut ini:
5'-GATATC-3'
::::::
3'-CTATAG-5'
Baik di utas atas maupun bawah memiliki sekuen yang sama bukan (dibaca dari 5′ ke 3′)? Nah, di sekuen palindrom seperti itulah enzim restriksi akan bekerja.
Setiap enzim restriksi hanya dapat memotong pada susunan palindrom tertentu. Misalnya enzim EcoRI akan bekerja jika menemukan urutan GAATTC, enzim SmaI pada urutan CCCGGG, enzim AluI pada urutan AGCT, dan seterusnya.
Cara pemotongan DNA pun tidak sembarangan, masing-masing enzim punya titik pemotongan tertentu yang khas. Misalnya BamHI yang mengenali situ GGATCC akan memotong pada posisi antara dua G membentuk fragmen yang ujungnya ada yang tidak berpasangan (cohesive atau sticky ends).
5'-G GATCC-3'
: :
3'-CCTAG G-5'
Sedangkan enzim PovII yang mengenali situs CAGCTG akan memotong di tengah situs pemotongan membentuk fragment yang semua ujungnya berpasangan (blunt ends):
5'-GGA TCC-3'
::: :::
3'-CCT AGG-5'
Ada sekitar 600 enzim restriksi yang tersedia secara komersial saat ini. Berikut ini beberapa contoh enzim restriksi beserta situs pemotongannya.
List of Restriction Enzyme (Image from ncbi.nlm.nih.gov)
Situs Pengenalan dan Pemotongan Enzim Restriksi (Image from ncbi.nlm.nih.gov)
Penamaan Enzim Restriksi
Kalau diperhatikan, nama enzim restriksi ini keren-keren juga. Ternyata ada maksudnya lho, begini aturannya:
- Huruf pertama adalah singkatan nama genus bakteri pemilik enzim tersebut
- Huruf kedua dan ketiga adalah singkatan nama spesies bakteri.
- Huruf keempat adalah dingkatan nama Strain.
- Huruf kelima adalah urutan penemuan enzim tersebut.
Misalnya EcoRI berasal dari Escherichia coli strain RY13 yang pertama kali diidentifikasi, HindIII dari Haemophilus influenzae, dan lain-lain.
Bagaimana ‘Lem’ DNA Bekerja?
Enzim DNA ligase bekerja dengan menyambungkan utas DNA yang memiliki ujung 5′-PO4 dengan ujung 3′-OH pada utas lain. Mekanismenya bisa bermacam-macam, misalnya:
Ligation of Sticky Ends DNA (Image from wikipedia.org)
- Menyambungkan utas-utas DNA yang sama-sama memiliki ujung overhang hasil pemotongan enzim restriksi. Ujung overhang ini harus saling komplemen agar dapat menempel dengan baik. Ujung overhang pada utas sense akan berpasangan dengan ujung overhang utas antisense. Lalu DNA Ligase tinggal membentuk ikatan phosphodiester sehingga kedua utas kini sudah menjadi satu dengan ikatan yang sangat kuat. Mekanisme ini cenderung lebih mudah karena kedua ujung overhang dapat menempel lebih dulu karena memiliki sekuen yang saling komplemen.
Ligation of Blunt Ends DNA (Image from wikipedia.org with modification)
- Menyambungkan utas-utas DNA yang sama-sama memiliki ujung blunt hasil pemotongan enzim restriksi atau hasil blunt PCR. DNA dengan ujung blunt lebih sulit untuk ‘dilem’ dengan enzim DNA Ligase karena tidak ada ujung overhang yang membantu kedua utas untuk saling menempel terlebih dulu sebelum ‘dilem’
Beberapa Sifat Khusus Enzim Restriksi
Isochizomer
Isochizomer adalah enzim-enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan yang sama. Hasil pemotongannya bisa sama dan bisa juga berbeda. Misalnya HpaII (situs pengenalan: C↓CGG) dan MspI (situs pengenalan: C↓CGG) adalah isoschizomer, begitu pula AatI (AGG↓CCT) dan StuI (AGG↓CCT).
Neoschizomer
Neoschizomer adalah bagian dari isoschizomer, memiliki situs pengenalan yang sama tetapi memotong pada tempat yang berbeda sehingga hasil pemotongannya pun berbeda. Misalnya AatII (situs pengenalan: GACGT↓C) dan ZraI (situs pengenalan: GAC↓GTC).
Tabel yang berisi daftar isoschizomer dan neoschizomer dapat ditemukan di situs NEB (New England Biolabs).
Kompatibilitas Ujung Overhang
Ada beberapa enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan berbeda tetapi hasil pemotongannya memiliki ujung overhang yang sama. Misalnya AccIII (T↓CCGGA) dengan AgeI (A↓CCGGT) yang menghasilkan ujung overhang CCGG.
Sifat ini sangat penting dalam aspek rekayasa genetika, terutama bila fragmen DNA yang akan kita klon memiliki situs pengenalan enzim restriksi yang berbeda dengan vektornya. Asalkan hasil pemotongan memiliki ujung overhang yang sama maka proses ligasi dapat dilakukan kemudian.
Aplikasi ‘Gunting’ dan ‘Lem’
Nah, dengan menggunakan bantuan kedua jenis enzim ini, para ilmuwan rekayasa genetika bisa mengutak-atik DNA untuk keperluan tertentu seperti rekombinasi DNA yang menghasilkan DNA rekombinan. Secara garis besar berikut adalah proses yang terjadi:
Cloning gene of interest into plasmid (Image from bio.davidson.edu)
Masih banyak aplikasi lain dari enzim restriksi dan DNA ligase, kita akan coba bahas dalam artikel lain. Jangan lupa memberikan komentar untuk kami.
Mana yang lebih baik untuk melarutkan DNA/RNA? TE Buffer atau ddH2O? Pertanyaan ini seringkali muncul dan menjadi bahan diskusi yang menarik. Dan ternyata masing-masing memiliki kelebihan dan kelemahan sehingga pelarut mana yang dipilih amat bergantung pada tujuan kita melarutkan DNA/RNA.
DNA Precipitate | Image from http://www.biotechlearn.org.nz/
TE Buffer
TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. Berikut ini resep pembuatannya:
Larutan Tris-HCl 1 M pH 7.5
Untuk membuat 1 L larutan:
- Tambahkan 121.14 g Tris Base (BM = 121.14 g/mol) ke dalam 800 mL ddH2O
- Atur pH hingga mencapai pH 8.0 dengan larutan HCl 4N
- Tambahkan ddH2O hingga volumenya tepat 1 L
Catatan: Nama kimia dan nama lain dari Tris base adalah 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol, THAM, Tris(hydroxymethyl)aminomethane, atau Trometamol
Larutan EDTA 500 mM pH 8.0
Untuk membuat 1 L larutan:
- Tambahkan 186,12 g Sodium EDTA dihydrate (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) atau 146.12 g EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) ke dalam 800 mL ddH2O
- Atur pH hingga mencapai pH 8.0 dengan larutan NaOH 4 N
- Tambahkan ddH2O hingga volumenya tepat 1 L
Untuk membuat 1 L larutan Stok TE Buffer 10X, campurkan larutan-larutan berikut ini:
- 100 ml Tris-HCl 1 M pH 7.5
- 20 ml EDTA 500 mM pH 8.0
- 880 ml ddH2O
Larutan diaduk hingga bercampur sempurna.
Larutan TE Buffer dapat disterilkan menggunakan autoclave.
ddH2O
ddH2O atau disebut juga aqua bidestillata atau ultrapure water, adalah air yang sangat murni, lebih murni dari aquadest atau pun air reverse osmosis karena telah melalui berbagai macam cara pemurnian. Pada awalnya orang melakukan destilasi kembali pada air yang telah didestilasi, namun saat ini digunakan kombinasi berbagai jenis pemurnian untuk memperoleh ultrapure water ini (Artikel tentang tingkat kemurnian air dapat dilihat selengkapnya di sini).
Secara umum ddH2O dibuat dengan melewatkan aquadest ke dalam suatu cartridge berisi resin-resin filter dan deionisasi untuk menghilangkan ion-ion dari air, hingga diperoleh nilai hantaran listrik yang sangat kecil (sekitar 5.5 × 10−6 S·m−1 atau 18 MΩ cm), terakhir air tersebut dilewatkan melalui filter membran dengan pori-pori 0.22 µl. Biasanya ddH2O tidak perlu disterilkan lagi menggunakan autoclave.
Mana yang Lebih Baik?
Kedua pelarut di atas paling umum digunakan untuk melarutkan DNA atau RNA, karena keduanya dapat melarutkan DNA atau RNA dengan baik. Namun untuk alasan stabilitas dan tujuan pemakaian DNA atau RNA, maka keduanya memiliki keunggulan dan kelemahan masing-masing.
DNA atau RNA akan lebih stabil jika dilarutkan dalam TE buffer karena pH-nya djaga sekitar 8. Ingat bahwa fungsi utama buffer adalah menyangga pH pada nilai tertentu. Jika dilarutkan dalam ddH2O, ada peluang untuk berubahnya pH. Ini dapat terjadi karena DNA dan RNA memiliki sifat asam lemah (ingat: DNA=asam deoksiribonukleat, RNA=asam ribonukleat), yang dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi DNA/RNA, apalagi DNase juga bekerja pada pH yang sedikit asam. Jadi untuk alasan kestabilan, buffer TE lebih unggul dibanding ddH2O.
Meskipun TE buffer membuat stabil DNA, tapi kita harus berhati-hati jika DNA atau RNA tersebut akan digunakan untuk aplikasi enzimatis seperti PCR (Polymerase Chain Reaction). Kenapa begitu? Karena TE buffer mengandung EDTA, yang dapat membentuk senyawaan kompleks dengan ion logam seperti Mg2+. Dalam hal ini EDTA merupakan chelating agent. Padahal Mg2+ adalah prekursor untuk enzim Taq DNA polymerase yang digunakan pada reaksi PCR, jadi kalau jumlah EDTA pada larutan DNA atau RNA cukup banyak, bisa menyebabkan reaksi PCR menjadi terhambat karena enzim DNA polymerase-nya tidak dapat bekerja secara sempurna. Jadi utk alasan ini, ddH2O lebih unggul dibanding TE buffer karena ddH2O tidak mengandung chelating agent.
Jadi, aplikasi lanjutan dari sampel DNA atau RNA akan menentukan pilihan kita. Jika DNA atau RNA akan segera digunakan untuk aplikasi PCR, lebih baik menggunakan ddH2O sebagai pelarut. Jika bukan dan akan disimpan dalam waktu yang cukup lama, TE buffer lah pilihannya. Tapi bisa saja kita mengakalinya dengan mengganti TE buffer dengan Tris-HCl buffer pH 8 karena tidak mengandung EDTA. Larutan Tris-HCl buffer ini sering digunakan sebagai elution buffer pada kit-kit purifikasi DNA/RNA komersial.
Satu hal lagi yang harus diingat, TE buffer atau ddH2O yang digunakan untuk melarutkan RNA harus bebas RNase, yaitu yang sudah di-treatment dengan DEPC (Diethyl Pyrocarbonate).
Selain itu, faktor penyimpanan juga sangat berpengaruh terhadap kestabilan larutan DNA atau RNA. Hal-hal berikut harus diperhatikan:
- Simpanlah larutan DNA atau RNA pada suhu -20oC atau -80oC (untuk RNA)
- Jangan sering-sering melakukan freeze-thaw, lebih baik melakukan aliquot dengan membagi larutan DNA atau RNA ke dalam beberapa tabung dengan volume lebih kecil.
So, apakah ada argumen lain yang bisa diungkapkan? Silakan tinggalkan komentar untuk kami.
Air yang digunakan di laboratorium memiliki tingkat kemurnian yang berbeda-beda, bergantung untuk apa air itu digunakan. Kemurnian air untuk mencuci alat-alat gelas tentu berbeda dengan yang digunakan untuk membuat larutan pereaksi, membuat media penumbuh bakteri atau membuat mastermix PCR misalnya.
Water for Laboratory Purposes (Image from www.newwaterinc.com)
Tahukah Anda bahwa air di alam yang paling bersih sekalipun, seperti mata air, tidak dapat langsung digunakan untuk keperluan di laboratorium? Walaupun air tersebut terlihat jernih, bening, dan telah melalui proses penyaringan alami dalam tanah, ia masih mengandung ion-ion terlarut yang berasal dari unsur hara tanah. Apalagi air yang telah mengalir di sungai dan melalui pemukiman dan industri, bisa terbayang banyaknya pengotor yang terkandung dalam air tersebut.
Nah, air murni yang digunakan di lab bisa juga berasal dari air seperti itu, namun sebelumnya harus melalui berbagai proses sehingga kandungan pengotornya menjadi sesedikit mungkin. Tentu saja kita tidak bisa membuat air murni dari air sungai kotor dengan sekali proses, harus ada beberapa tahapan yang dilalui. Lalu, proses apa saja yang bisa dilakukan untuk memurnikan air, dan bagaimana pula tingkatan kemurnian air tersebut?
1. Destilasi
Ini merupakan teknik tertua diantara teknik-teknik lainnya. Air dipanaskan hingga mencapai titik didihnya, kemudian uap air yang dihasilkan dikondensasi hingga mengembun kembali menjadi cairan (dinamakan “destilat”). Teknik ini akan menyingkirkan banyak pengotor, namun pengotor yang memiliki titik didih sama atau lebih rendah dari air akan tetap terbawa dalam destilat.
2. Mikrofiltrasi
Jika air dilewatkan pada suatu penyaring dengan ukuran pori-pori yang sangat kecil (1 hingga 0.1 mikron) sambil diberikan tekanan, maka pengotor-pengotor yang berukuran lebih besar dari pori-pori dapat disingkirkan. Penyaring dengan pori-pori yang lebih kecil dari 0.2 mikron dapat menyingkirkan bakteri (ini dinamakan sterilisasi dingin).
3. Ultrafiltrasi
Pori-pori penyaring yang digunakan lebih kecil dari mikrofiltrasi, hingga mencapai 0.003 mikron. Cara ini bahkan bisa menyingkirkan molekul-molekul dengan ukuran lebih besar dari pori-pori. Cara ini bisa mengenyahkan virus, endotoksin, RNase dan DNase.
4. Reverse Osmosis
Jika Anda menganggap bahwa pori ultrafiltrasi adalah yang terkecil, ternyata ada lagi yang lebih kecil, yaitu pori-pori filter reverse osmosis yang mencapai 0.001 mikron saja. Ukuran pori tersebut dapat menyaring ion-ion berdasarkan ukurannya. Metode ini digunakan untuk menghilangkan garam-garam pada air (desalting).
5. Filtrasi melalui karbon aktif
Metode ini sangat bermanfaat untuk mengenyahkan ion-ion seperti ion klorida maupun senyawaan organik, karena mereka akan teradsorbsi pada permukaan karbon aktif.
6. Radiasi UV
Cara ini memang tidak dapat menghilangkan pengotor dari air, tetapi radiasi UV pada panjang gelombang tertentu, dapat merusak DNA dan mikroorganisme. Jadi dengan UV mikroorganisme dalam air akan mati. Selain itu beberapa senyawaan organik juga dapat diurai menjadi produk yang lebih tidak berbahaya.
7. Deionisasi/Pertukaran Ion
Cara ini akan menghilangkan ion-ion dari air dengan melewatkannya melalui suatu tabung berisi resin yang terdiri atas campuran resin kationik dan anionik. Ion-ion positif pengotor akan tertarik ke partikel-partikel resin kationik sedangkan ion-ion negatif ke resin anionik. Air yang keluar dari tabung resin sudah terbebas dari ion-ion pengotor.
Air yang tersedia secara komersial menggunakan kombinasi dari teknik-teknik di atas, sehingga memiliki kemurnian sesuai kriteria yang diinginkan. Jika alat dan bahan yang diperlukan untuk memurnikan air tersedia di lab, kita pun dapat membuatnya sendiri, mengapa tidak?
Sumber: BiteSizeBio
Membuat kontrol eksperimen memang merepotkan, tapi eksperimen tanpa kontrol ibarat mencari koin yang jatuh di kegelapan.
Blue-white colony screening (Image from promega.wordpress.com)
Dalam setiap eksperimen, kontrol merupakan salah satu faktor yang amat sangat penting. Interpretasi hasil eksperimen akan sangat sulit bahkan tidak mungkin dilakukan tanpa kontrol. Tak terkecuali dalam eksperimen TA Cloning.
Bagi kita yang bergelut di bidang biologi molekuler khususnya genetic engineering pasti tak asing dengan istilah TA Cloning. Eksperimen ini umum dilakukan untuk membuat fragmen DNA seperti produk PCR menjadi DNA sirkuler (plasmid). PCR produk yang ujungnya memiliki A overhang –tergantung enzim Taq Polymerase yang digunakan saat PCR– diligasikan (disambungkan) ke suatu vector yang memiliki T overhang, A dengan T jadi klop berpasangan. Dengan bantuan enzim DNA Ligase maka vektor dan PCR produk bisa tersambungkan menjadi plasmid alias DNA sirkuler. Plasmid ini bisa digunakan untuk berbagai keperluan, diantaranya mengklon gen suatu organisme ke organisme lainnya.
Kembali ke masalah kontrol eksperimen, sebagian orang beranggapan membuat kontrol hanyalah pemborosan waktu, energi dan biaya. Padahal tanpa adanya kontrol, maka tak ada cara simpel lain untuk mengetahui seberapa baguskah sel yang kita gunakan. Dan begitu keesokan harinya kita mendapati plate tanpa koloni putih, kita akan bingung, apakah sel yang kita gunakan tidak kompeten? Apakah transformasinya yang gagal? Atau ligasinya yang error? Kerja kita seharian akan jadi sia-sia saja.
Kontrol yang diperlukan
Agar hal itu tidak terjadi, tak apalah kita repot sedikit untuk membuat beberapa kontrol berikut:
1. Kontrol Ligasi Vektor
Dalam TA Cloning, seringkali kita khawatir terjadinya self-ligation vektor itu sendiri tanpa adanya insert. Jika metode blue-white screening yang kita gunakan, boleh jadi kita mendapati beberapa koloni putih yang sebetulnya tidak memiliki insert.
Meskipun koloni putih seperti ini biasanya tidak lebih dari 1 – 2% saja dari total koloni, tapi dengan adanya kontrol ligasi vektor (vektor + enzim ligase tanpa insert) kita akan punya gambaran seberapa besar background yang akan kita temukan dalam plate eksperimen.
2. Kontrol Transformasi
Setiap kali vial sel bakteri dikeluarkan dari freezer penyimpanannya, maka perlu dilakukan kontrol transformasi dengan cara mentransformasi plasmid utuh dengan jumlah tertentu ke dalam sel bakteri tersebut.
Kontrol transformasi akan memberi informasi penting berikut:
- apakah sel bakteri yang kita gunakan masih kompeten
- apakah plate media yang digunakan masih cukup fresh untuk menumbuhkan bakteri
- apakah seluruh tahapan kerja yang kita lakukan sudah benar
3. Kontrol Positif
Untuk meyakinkan apakah seluruh komponen bekerja dengan baik, kita bisa menggunakan insert dan vektor yang sebelumnya telah berhasil diligasikan dan ditransformasikan. Atau bisa juga menggunakan kontrol positif yang biasanya disertakan dalam kit TA Cloning.
Jadi dengan adanya kontrol kita bisa tahu faktor penyebab jika terjadi kegagalan dalam TA Cloning ini. Selanjutnya faktor tersebut lah yang harus kita perbaiki ketika mengulang eksperimen.
Tips seputar TA Cloning
Untuk mengurangi risiko kegagalan, berikut ini ada beberapa tips yang mungkin bisa membantu:
1. Buffer ligase harus di-thaw dan di-mix sempurna sebelum digunakan. Biasanya terdapat endapan putih salah satu komponen dalam buffer ligase, pastikan endapan tersebut terlarut sempurna sebelum digunakan. Pelarutan bisa dibantu dengan inkubasi selama 2 menit pada waterbath suhu 37C.
2. Hindari freez-thaw sel kompeten berulang-ulang, karena bisa mengurangi kemampuannya. Usahakan mengaliquot sel kompeten dengan volume yang cukup untuk satu kali transformasi saja.
3. Gunakan plate yang fresh. Jangan gunakan plate yang disimpan pada suhu 4C lebih dari satu minggu. Jangan pula menambahkan antibiotik ketika cairan media agar masih panas. Hangatkan plate terlebih dahulu pada suhu 37C selama 30 menit sebelum dilakukan plating.
Wah, Semuanya Biru
Jika yang kita peroleh pada plate hanya koloni biru, memang kemungkinannya adalah tidak ada insert pada plasmid yang kita transformasikan. Tapi ada beberapa kemungkinan lain yang tidak kita sadari:
1. Ukuran insert kita terlalu kecil untuk membuat gen lacZ terinaktifasi.
2. Insert kita ada pada posisi in-frame dengan gen lacZ sehingga lacZ-nya tetap aktif.
Dalam kedua kasus di atas, mungkin kita akan menemukan koloni-koloni biru yang warnanya lebih muda dibanding koloni biru lain yang lebih gelap. Artinya meskipun prosedur kloning sudah berjalan dengan baik namun insert kita ukuran dan framenya tidak pada posisi yang tepat untuk membuat koloni menjadi putih. Jika kita men-screening koloni biru muda, mungkin saja kita akan menemukan klon yang diharapkan di sana.
3. Insert yang kita klon bersifat meracuni (toxic) bagi sel bakteri host-nya. Kadang-kadang inkubasi pada suhu 30C (normalnya 37C) bisa membantu mengurangi efek toxic ini.
Bagaimana dengan pengalaman Anda dalam TA Cloning? Apakah ada tips lain yang belum tercakup di sini? Kita tunggu comment-nya ya.
Image from bcit.ca.
Laboratorium adalah tempat bahan kimia berbahaya mangkal. Tapi seringkali kita melakukan hal-hal konyol di lab yang dapat membahayakan diri sendiri dan orang-orang di sekitar kita, kita sering lupa untuk mengimplementasikan Lab Safety. Apa sajakah itu? Dan apakah kita termasuk yang terbiasa melakukannya?
Bekerja dengan Bahan Kimia Tanpa Panduan MSDS
Seberapa sering kita membaca MSDS saat hendak bekerja dengan bahan kimia? Jangan-jangan di lab kita nggak ada MSDS untuk bahan-bahan kimia yang digunakan? Wah gawat itu. Coba periksa kembali dokumen yang ada di lab.
MSDS alias Material Safety Data Sheet adalah dokumen pendamping suatu bahan kimia yang menjelaskan semua hal terkait dengan keselamatan dalam menggunakan bahan tersebut. Misalnya di MSDS dijelaskan mengenai Alat Pelindung Diri (APD) apa saja yang harus kita kenakan. Jangan sampai hanya dengan memakai jas lab dan sarung tangan saja kita sudah merasa aman dan terlindungi, siapa tahu ketika dilihat lagi di MSDS ternyata bahan karsinogenik yang sehari-hari kita pakai itu bersifat agak mudah menguap. Bayangkan apa jadinya jika berbulan-bulan sebelumnya kita telah menghirup sedikit demi sedikit uap karsinogenik tersebut tanpa kita sadari hanya karena tidak membaca MSDS.
Agar mudah ditemukan, tempatkan kumpulan MSDS di suatu tempat yang mudah diakses dekat penyimpanan bahan kimia. Dan biasakan untuk mengupdate-nya setiap kali ada bahan kimia yang baru dibeli.
Memakai Jas Lab Kemana-mana
Jas lab adalah pakaian pelindung tubuh dan pakaian biasa kita dari kotoran-kotoran dan bahan-bahan kimia berbahaya, artinya jas lab itu sendirilah yang kotor terkena bahan kimia. Sebersih apapun lab kita, yang namanya bahan kimia bisa berseliweran dimana-mana. Saat menimbang, menuang cairan atau memanaskan sesuatu, tentu saja ada sebagian yang menguap/beterbangan, dan akhirnya menempel di jas lab kita.
Jadi biasakanlah hanya menggunakan jas lab di dalam lab saja, ketika ada pengarahan dari boss di ruang meeting, makan di kantin, atau fotokopi dokumen di ruang administrasi, jangan memakai jas lab, biasakan untuk melepasnya dulu sebelum keluar dari lab. Sebab jika kemana-mana kita berjaslab ria sama artinya dengan menyebarkan bahan berbahaya ke seluruh ruangan.
Yang lebih berbahaya jika kita bekerja di lab tanpa mengenakan jas lab, karena selain membahayakan diri sendiri dan menyebarkan bahan berbahaya ke seluruh ruangan kantor, kita pun akan membawanya pulang ke rumah.
Sarung Tangan juga Bisa Bahaya
Fungsi sarung tangan adalah melindungi tangan kita saat bekerja dengan bahan berbahaya, jadi seperti jas lab, otomatis bagian luar sarung tangan akan dipenuhi oleh ceceran benda berbahaya tadi. Nah, tak jarang kita masih menggunakan sarung tangan kotor saat berpindah dari satu ruangan ke ruangan lain, dan kita tidak sadar kalau kotoran tadi bisa menempel ke gagang pintu, keyboard komputer atau benda-benda lain yang tersentuk sarung tangan kita. Yang jadi korban tentu saja semua orang di lab.
Kebiasaan lain adalah terlalu menghemat sarung tangan, mentang-mentang ingin berhemat kita menggunakan satu sarung tangan untuk sehari penuh, habis pakai, disimpan, dipakai lagi. Hmm… sadarkah apa yang terjadi?
Malas Menggunakan Kacamata Pelindung (Googles)
Jika kita sayang pada mata kita yang hanya dua, jangan malas menggunakan googles. Selama kita bekerja di lab ada kemungkinan mata kita terpercik serbuk, cairan atau asam, syukur-syukur jika tidak sampai membuat mata rusak, tapi kalau sampai merusak tentu kita akan menyesal seumur hidup.
Memakai Googles tapi Tidak Anti-UV
Hati-hati jika hendak bekerja dengan sinar UV. Meski mata kita dilindungi googles, tapi cek dulu apakah googles kita memiliki pelindung dari sinar UV atau tidak. Jika kita menengok langsung hasil elektroforesis gel yang divisualisasi dengan UV transilluminator tanpa googles yang anti UV, yang jadi korban adalah retina mata kita.
Memakai Googles Anti UV, tapi Tangan Telanjang
Jika kita bekerja di lab DNA, tentu sering melakukan purifikasi DNA dari gel, yang biasanya dilakukan adalah memotong bagian gel yang ada DNA-nya sambil disinari UV agar DNA terlihat. Tanpa kita sadari, meski mata dilindungi googles tapi kita sering lupa memakai sarung tangan, padahal saat memotong gel, tangan kita akan terpajan (terekspos) sinar UV. Mata selamat tapi tangan terbakar UV. So, jangan lupa memakai sarung tangan, jas lab berlengan panjang dan kalau perlu pake sunblock.
Jurus ‘Kirata’ untuk Centrifuge
Keseimbangan berat sangat vital dalam sentrifugasi, kalau tabungnya tidak seimbang maka alat sentrifugasi akan bergetar hebat bahkan bisa merusak rotor dan alatnya, apalagi untuk superspeed centrifuge dengan kecepatan tinggi. Jangan mengandalkan mata untuk menyeimbangkan dua tabung sentrifugasi yang saling berhadapan, kecuali mata kita punya ketelitian membedakan bobot hingga 0.1 g. Meskipun mata kita melihat volume cairan di dalamnya sama, tetap luangkan waktu sebentar untuk menimbangnya dan pastikan perbedaan bobot keduanya tidak lebih dari 0.1 g.
Makan-minum di dekat meja kerja
Makan-minum umumnya dilarang keras saat kita berada di lab. Meski kita yakin aman-aman saja makan-minum di meja lain yang dekat dengan meja kerja lab, tapi apakah kita yakin tak ada uap atau serbuk halus bahan kimia/mikroba yang berseliweran?
Menyulap Lab Jadi Dapur
Kadang-kadang perbedaan antara lab dan dapur hanya tipis saja, di lab ada microwave oven, ada kulkas/referigerator dan aja juga air putih (aquadest). Apakah Anda termasuk orang yang pernah menyimpan makanan/cemilan/minuman di kulkas lab? atau memanaskan bekal makan siang di microwave yang juga dipakai untuk memanaskan gel agarose? atau menggunakan aquadest untuk menyeduh kopi? Kalau iya, coba pikirkan lagi baik-baik.
Membuka Botol Cairan Beracun di Luar Fume Hood
Lab biotek biasanya tidak bisa lepas dari yang namanya cairan beracun seperti beta-mercaptoethanol (BME). BME ini sering digunakan untuk ekstraksi DNA/RNA, baunya sangat menyengat dan yang penting diketahui, BME sangat beracun, bisa menyebabkan iritasi saluran nafas jika terhirup, muntah dan sakit perut kalau terminum atau terabsorpsi melalui kulit sehingga meracuni tubuh.
Jadi, kasihanilah diri kita dan rekan-rekan di lab jika kita masih nekat bekerja dengan BME di luar fume hood.
Melongokkan Kepala ke Fume Hood atau Laminar Air Flow Hood
Terkadang secara tidak sadar kita memasukkan kepala ke dalam fume hood atau laminar air flow hood. Padahal kalau kepala kita masuk ke fume hood, kepala kita yang jadi tidak terlindungi dari bahan-bahan berbahaya, sementara kalau saat bekerja dengan laminar air flow, eksperimen kita lah yang jadi korbannya karena tercemari kontaminan dari kepala kita.
Kebiasaan buruk lain apalagi yang sering Anda lakukan di lab? Anda bisa sharing di kotak komentar di bawah ini agar kita tau dan waspada.
Sumber: Pengalaman sehari-hari 
dan BiteSizeBio.com
![Bakteri purba dari sedimen sub-permukaan [image from: the-scientist.com]](http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2012/05/20120523-074119-60x33.jpg "Bakteri purba dari sedimen sub-permukaan [image from: the-scientist.com]"){kind=small}
