Alat DNA Sequencer
Hasil analisa DNA sequencing idealnya terdiri atas peak-peak yang terbaca dengan jelas, memiliki baseline noise rendah, background yang tidak signifikan dan memiliki spasi antar peak yang merata. Namun pada kenyataannya terkadang electropherogram dari sampel kita jauh dari harapan dan mengandung banyak ‘keanehan-keanehan’. Apa saja keanehan yang sering terjadi dan mengapa bisa terjadi? +Continue Reading
Teknologi DNA Sequencing yang umum digunakan saat ini adalah Dye-terminator sequencing, dimana output alat sequencer-nya adalah peak-peak yang terdiri atas 4 warna yang mewakili masing-masing nukleotida yaitu hijau untuk Adenine (A), merah untuk Thymine (T), biru untuk Cytosine (C) dan hitam untuk Guanine (G). Peak inilah yang dinamakan electropherogram. Electropherogram ini sudah diinterpretasikan (call) secara otomatis oleh program computer DNA Sequencer menjadi urutan-urutan basa nukleotida (A-C-G-T), namun masalahnya seringkali program komputer melakukan ‘kesalahan’ interpretasi pada electropherogram yang bermasalah sehingga urutan basa nukleotida yang dihasilkannya pun bisa salah. Hal ini tentu saja berpengaruh terhadap hasil penelitian dan juga analisa lanjutan yang akan kita lakukan terhadap hasil sekuensing tersebut.
Oleh karena itu, mutlak adanya interpretasi manual menggunakan ‘mata kepala sendiri’ untuk mencari peak-peak yang ambigu dan membuang bagian electropherogram yang mengandung terlalu banyak error. Berikut ini akan diuraikan masalah yang sering timbul pada electropherogram, apa penyebabnya dan bagaimana kita bisa mendapatkan interpretasi yang benar.
Electropherogram yang bersih memiliki ciri sebagai berikut:
Berikut ini adalah contoh electropherogram, coba perhatikan tingkat kebersihan baseline-nya.
| [simage=163,400,y,left] |
| [simage=164,400,y,left] |
| [simage=165,400,y,left] |
Gambar 1 adalah electropherogram yang sangat bagus, excellent tanpa noise sama sekali. Pada gambar 2 terlihat sedikit noise pada baseline tetapi peak utamanya masih sangat jelas dan komputer tidak melakukan kesalahan pembacaan sama sekali. Sedangkan pada gambar 3 noise-nya cukup tinggi sehingga mempengaruhi pembacaan (call) pada komputer. Coba perhatikan peak nomor 271, 273 dan 279 yang terdiri dari lebih satu warna, begitu pula pada posisi 291 dan 301 dimana terdapat peak yang menyisip diantara dua peak, dan yang paling parah pada posisi 310 yang sangat sulit untuk ditentukan manakah peak yang sebenarnya.
Noise seperti itu umum terjadi ketika sinyal sampel sequencingnya terlalu redup, ini bisa dilihat dari ‘signal intensity’ dari electropherogram yang ada pada windows yang berbeda pada program ‘Electropherogram viewer’ di komputer atau pada bagian atas hasil print-out electropherogram. Biasanya terlihat seperti berikut ini:
Signal G:168 A:110 T:160 C:186
Signal yang sangat baik memiliki nilai antara 500 – 2000 (meskipun nilai ini bervariasi antar instrument sequencer), signal antara 50 – 100 pun kadang-kadang memberikan hasil yang bagus namun tentu saja disertai dengan ‘bonus’ berupa noise. Biasanya bagian awal Electropherogram memiliki noise yang rendah dan semakin ke bagian akhir semakin meningkat pula noisenya, hal ini termasuk ‘normal’ karena keterbatasan teknologi kapiler yang digunakan, namun noise ini semakin menjadi-jadi jika dalam sampel masih terdapat sisa-sisa garam.
Namanya juga komputer, buatan manusia, tentu saja bisa salah menginterpretasikan peak pada electropherogram, malahan mata manusia bisa lebih baik dalam hal ini. Kadangkala komputer membaca peak-peak yang ambigu menjadi ‘N’, padahal mata manusia bisa melihat dengan jelas peak apa sebenarnya yang ada di situ. Oleh karena itu kita perlu melakukan pemindaian alias ‘scanning’ pada electropherogram untuk mencari peak-peak yang sangat kecil/rendah, nukleotida yang terbaca sebagai ‘N’ atau peak-peak yang jarak/spasinya lain daripada yang lain.
Cobalah perhatikan electropherogram sampel kita, pindailah peak-peaknya apakah terdapat spasi antara 2 peak yang terlalu rapat atau terlalu renggang, begitu pula pada spasi antar huruf ACGT yang ada di atas peak. Seperti pada gambar 4 berikut, jarak antara G dan A pada posisi 271 dan 272 lebih renggang dibanding peak-peak lainnya, ini memang error yang umum pada sequencer kapiler ABI, namun karena software sudah memprediksi error ini, dimana jarak antara peak G yang langsung diikuti oleh peak A umumnya lebih besar, maka hasil pembacaan electropherogram tidak terpengaruh.
| [simage=166,160,y,left] | [simage=167,160,y,left] | [simage=168,160,y,left] |
Tetapi terkadang spasi yang terlalu lebar diartikan sebagai ‘N’ oleh software, padahal secara kasat mata terlihat bahwa tidak ada peak di bawah ‘N’ seperti yang terlihat pada gambar 5 pada posisi peak 66. Bahkan pada gambar 6 terlihat ada basa ‘G’ yang disisipkan antara peak 58 dan 60, padahal pada posisi 59 tersebut yang ada hanyalah peak noise pada baseline, tetapi software membacanya sebagai ‘real peak’. Tentu saja hal ini dapat berakibat fatal terhadap pembacaan electropherogram.
Idealnya satu posisi peak hanya terdiri atas satu warna saja, namun bisa saja terjadi satu posisi diisi oleh lebih dari satu warna peak, biasanya jika produk PCR yang disekuensing berasal dari DNA genom diploid, dimana posisi yang polimorfik akan memunculkan kedua nukleotida secara simultan. Hasil pembacaannya bisa jadi ‘N’ atau salah satu peak yang lebih tinggi.
| [simage=169,160,y,left] | [simage=170,160,y,left] |
Gambar 7 merupakan contoh yang sangat jelas akan adanya SNP (single nucleotide polymorphism) heterozygous, pada kasus ini salah satu alel memiliki basa C dan satunya lagi T, dan keduanya nampak jelas sebagai dua peak yang saling menumpuk, dan dibaca oleh software sebagai ‘N’. Sementara itu pada gambar 8 sekilas tidak nampak adanya SNP karena pada posisi peak 192 terbaca sebagai C, padahal di situ terdapat pula peak G yang lebih rendah.
Pemindaian dengan mata bisa saja dilakukan untuk mencari peak heterozygous seperti ini, namun jika jumlah sampelnya sangat banyak tentu menjadi sangat tidak praktis. Untunglah beberapa software berikut dapat menolong kita melakukan pemindaian dan mendeteksi adanya peak heterozygous:
Ini merupakan keterbatasan dari teknologi capillary sequencing yang berbasis metode dye terminator sequencing. Peak yang sempurna sekalipun hanya memberikan data yang akurat hingga batas tertentu, selanjutnya peak-peak yang muncul akan semakin melebar dan bergeser sehingga software maupun mata manusia akan sulit untuk menginterpretasikan electropherogram tersebut secara akurat. Hasil pembacaan software pun seringkali tidak dapat diandalkan.
Tergantung dari kualitas sample sequencing, kapiler, polimer serta bahan-bahan pendukung lainnya, biasanya electropherogram memiliki kualitas peak yang baik hingga posisi 600-700an, setelah itu kualitasnya makin memburuk.
| [simage=161,288,y,left] |
| [simage=162,288,y,left] |
Pada gambar 9, kualitas peak sudah tidak sebaik yang seharusnya, selain ‘kaki’ yang makin melebar, dua peak sewarna yang berurutan terlihat menyatu, namun hasil pembacaan software masih akurat dan kita pun masih dapat melihat puncak masing-masing peak yang terlihat menyatu tersebut, seperti pada posisi 790-791, 792-793, 795-796 dan yang lainnya. Di samping itu jarak/spasi antar peak pun masih seragam dan tidak terlihat ‘keanehan’.
Lain halnya dengan electropherogram pada gambar 10, peak-peak yang menyatu sudah tidak nampak lagi masing-masing puncaknya (misalnya posisi 969-970, 973-974), juga muncul ‘N’ pada posisi 982 yang tidak bisa kita pastikan apakah di situ seharusnya G atau A, dan bisakah kita pastikan berapa jumlah A setelah itu?
Jadi kita harus berhati-hati pada bagian akhir electropherogram, lihatlah apakah terdapat nukleotida ganda yang seharusnya hanya satu, lalu benarkah hitungan jumlah nukleotida yang berurutan, dan bahkan kadang-kadang satu nukleotida yang diapit oleh deretan nukleotida yang sewarna ‘tenggelam’ di bawah peak yang sangat lebar tadi. Pokoknya jika melihat spasi yang tidak seragam, waspadalah.
Jika hasil pembacaan software sudah memiliki banyak error, interpretasi manual dengan ‘mata kepala sendiri’ sudah sangat sulit dilakukan dan error yang terjadi sudah di luar toleransi kebutuhan kita, maka abaikan saja sisa sekuen yang mengandung error tersebut. Hingga batas mana sekuen tersebut akan kita ambil bergantung pada kebutuhan dan tujuan kita melakukan DNA Sequencing. Beberapa peneliti yang hanya ingin melihat posisi intro-ekson atau hanya ingin mengetahui identitas suatu DNA bakteri misalnya, mungkin tidak terlalu terganggu dengan adanya sedikit error. Namun jika tujuan sequencing tersebut adalah untuk publikasi ilmiah atau pencarian SNP, maka error yang sedikit saja tidak dapat ditolerir, hanya sekuen dengan kualitas terbaik saja yang akan diambil.
Untuk mengatasi error yang terjadi, bisa dilakukan dengan cara mensekuen dari arah sebaliknya, sehingga ambiguitas pada satu arah sekuen bisa diatasi dengan hasil sekuen komplemennya.
Sumber: The University of Michigan, DNA Sequencing Core
DNA Sequencing (Image from servicexs.com)
Informasi genetik pada suatu makhluk hidup tersimpan pada DNA-nya. Nah, untuk mengetahui informasi genetik tersebut digunakan teknik DNA Sequencing, yaitu metode yang digunakan untuk menentukan urutan basa nukleotida (adenine, guanine, cytosine dan thymine) pada molekul DNA. Saat ini teknik DNA Sequencing sudah memasuki tahap baru yang mengarah pada large scale atau high-throughput sequencing, jutaan bahkan miliaran basa nukleotida DNA dapat ditentukan urutannya dalam sekali run saja.
+Continue Reading
image from www.fahad.com.
Sudoku (“Suuji wa dokushin ni kagiru“) yang berarti angka-angkanya harus tetap tunggal merupakan permainan teka-teki logika paralel yang unggul, sulit, rumit dan sepenuhnya membuat pemainnya ketagihan. Permainan yang mulai populer di Jepang pada tahun 1980 ini berasal dari kotak-kotak Latin yang di temukan oleh ahli matematika berkebangsaan Swiss Leonhard Euler pada abad ke 18 ini telah menyihir seluruh dunia dari anak kecil hingga orang tua. Tujuan permainan ini adalah melengkapi kisi-kisi, kolom, baris dan setiap blok dari sembilan kotak yang berisi angka-angka dari 1 sampai 9 tanpa pengulangan atau melewatkan salah satunya.
Dalam dunia bioteknologi, permainan sudoku ini telah menginspirasi para peneliti di Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) menemukan apa yang di sebut dengan “DNA Sudoku“. DNA Sudoku merupakan metode yang revolusioner dalam bidang Genome Sequencing, para peneliti di lab tersebut menggabungkan teori matematika yang telah berusia 2000 tahun dari China dan konsep dari ilmu kriptologi untuk mengembangkan DNA Sudoku. Diistilahkan seperti itu karena kesamaan konsep logika dan aturan kombinasi penempatan angka dengan permainan sudoku yang populer tersebut.
Strategi DNA Sudoku ini memungkinkan untuk menurunkan baik biaya ataupun waktu dalam proses sequencing DNA. Saat ini sudah terdapat teknik sequencing yang dikenal dengan multiplexing. Multiplexing memerlukan pengkodean dari setiap sample DNA yang jumlahnya ribuan sebelum digabung untuk disekuen secara bersamaan. Dengan mengunakan ide dari Sudoku peneliti di CSHL telah mampu mengelola kode-kode sample DNA yang beragam secara berkelanjutan dengan tidak memberi kode pada tiap sample DNA. Inti dari metode ini adalah inovasi dari strategi pooling yang ditemukan, dengan metode seperti ini proyek yang aslinya memerlukan dana 10 Juta US dolar bisa dipangkas menjadi 50.000-80.000 US dollar saja.
Metode ini baru cocok untuk analisa genotype yang memerlukan hanya potongan-potongan pendek dari genom individu yang akan disekuen untuk mengetahui apakah individu tersebut membawa varian tertentu dari satu gen atau mengetahui adanya mutasi. Metode ini masih dalam pengembangan untuk aplikasi teknologi sequencing yang revolusioner, laporan lengkap tentang “DNA Sudoku” akan dipublikasikan di jurnal Genome Research bulan Juli 2009 ini.
Sumber bacaan:
1. Apakah Sanger Dideoksi Sequencing itu dan apa bedanya dengan Fluorescent Sequencing Applied Biosystems?
Dengan Sanger Sequencing, DNA polymerase menyalin utas tunggal cetakan (template) DNA, dengan penambahan nukleotida kepada rantai yang terbentuk (produk ekstensi). Permanjangan rantai terjadi pada ujung 3′ dari primer, oligonukleotida yang menempel (anneal) pada template. Deoksinukleotida yang ditambahkan pada produk ekstensi dipilih berdasarkan pasaan basa yang cocok dengan template. Produk ekstensi tumbuh dengan pembentukan jembatan fosfodiester antara gugus 3′-hydroksil pada ujung primer yang memanjang dan gugus 5′-fosfat dari deoksinukleotida yang masuk (Watson et al, 1987). Pemanjangan terjadi pada arah 5′ -> 3′ (lihat gambar 7).
| [simage=25,320,n,left] |
| Gambar 7: Sintesis Utas DNA melalui pembentukan ikatan fosfodiester |
DNA polymerase dapat berinkorporasi juga dengan basa nukleotida analognya. Metode dideoksi pada DNA sequencing yanG dikembangkan oleh Sanger et al. (1977) memanfaatkan keuntungan kemampuan ini dengan menggunakan 2′-3′-dideoksi sebagai substrat. Ketika sebuah dideoksinukleotida berinkorporasi pada ujung 3′ rantai yang sedang memanjang, pemanjangan rantai dihentikan secara selektif pada A, C, G atau T, karena rantai kekurangan gugus 3′-hidroksil (lihat gambar 8).
| [simage=26,200,n,left] |
| Gambar 8: Empat warna/sequencing fluorescent satu lajur vs Satu warna/Sequencing Empat Lajur |
2. Apakah Cycle Sequencing itu?
Cycle Sequencing adalah sebuah metode sederhana dimana pengulangan denaturasi, annealing dan ekstensi secara berturut-turut dalam thermal cycler menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi (lihat gambar 9). Produk ini kemudian di-load kedalam del atau diinjeksikan ke dalam kapiler. Applied Biosystems menggunakan protokol cycle sequencing ini dalam kit DNA sequencingnya.
| [simage=27,200,n,left] |
| Gambar 9: Amplifikasi Linear Produk Ekstensi |
3. Apakah keuntungan dari cycle sequencing?
Keuntungannya adalah sebagai berikut:
4. Apakah Dye Terminator Cycle Sequencing itu?
Dengan pelabelan dye terminator, masing-masing keempat dideoxy terminators (ddNTPs) ditandai dengan suatu fluorescent dye yang berbeda-beda. Rantai yang tumbuh diterminasi dan dilabel secara simultan dengan dye yang berkorespondensi dengan basa tersebut (lihat gambar 10). Suatu primer yang tidak dilabel dapat digunakan. Reaksi dye terminator dapat dilakukan dalam sebuah tabung. Protokol ini membutuhkan langkah pemipetan yang lebih sedikit dibanding reaksi dye primer. Reaksi yang dilabel dengan empat warna dye di-load dalam sebuah lajur gel tunggal atau satu injeksi kapiler. Jika terjadi kesalahan terminasi, yaitu fragmen yang tidak diterminasi oleh dideoksinukleotida, maka tidak akan terdeteksi karena tidak ada dye yang menempel.
| [simage=28,200,n,left] |
| Gambar 10: Fitur-fitur reaksi Dye-Labeled Terminator |
5. Apakah Dye Primer Cycle Sequencing itu?
Dengan pelabelan dye primer, primer ditandai dengan empat pewarna fluorescent yang berbeda. Produk terlabel terbentuk dalam empat reaksi spesifik basa yang berbeda. Produk dari keempat reaksi ini lalu dicampur dan di-load kedalam satu lajur gel atau satu injeksi kapiler (lihat gambar 11). Dye primer chemistries umumnya menghasilkan intensitas sinyal yang lebih baik dibanding dye terminator chemistries. Primer yang terlabel tersedia secara komersial untuk situs-situs primer yang umum. Kita dapat juga melabel custom primer. Reaksi yang dilabel dengan empat warna dye di-load ke dalam lajur tunggal atau satu injeksi kapiler.
| [simage=29,200,n,left] |
| Gambar 11: Fitur-fitur of Dye-Labeled Primer Reactions |
6. Apakah Matrix Standard itu?
Overlap spektral yang presisi antara keempat dye diukur dengan menjalankan (running) fragmen DNA yang dilabel menggunakan masing-masing dye dalam kalibrasi spektral pada mesin ABI PRISM® Genetic Analyzer. Fragmen DNA yang dilabel dye ini dinamakan matrix standards. Software Data Utility kemudian menganalisa data dari sample matrix standard dan membuat file matrix. Nomor-nomor ini adalah internetan fluorescent yang dinormalisasi dan merepresentasikan suatu deskripsi matematis overlap spektral yang teramati diantara dye-dye. File-file matrix dalam file instrumen digunakan untuk jenis chemistry yang spesifik, dan menyediakan informasi bagi software Sequence Analysis sehingga memungkinkannya untuk mengkoreksi overlap spektral.
7. Apakah BAC End-Sequencing itu?
Bacterial artificial clones alias BAC adalah segmen besar DNA (100kb-200kb) yang diklonkan ke dalam bakteri dari spesies lain. Beberapa salinan dapat dibuat setelah kloning. Sekuen dari ujung BAC menyediakan penanda yang sangat spesifik. Sekuen ini kemudian dapat dibandingkan dengan pustaka BAC untuk konformasi.
8. Apakah yang dimaks dengan “Checking Clone Constructs”?
Ini merupakan cara untuk memverifikasi bahwa DNA yang kita inginkan sudah diklon dengan baik kedalam vektor menggunakan DNA sequencing.
9. Apakah Multicomponent Analysis itu?
Multicomponent analysis merupakan proses yang memisahkan keempat warna dye fluorescent menjadi komponen-komponen spektral tersendiri. Meskipun setiap dye mengemisikan fluoresensi maksimumnya pada panjang gelombang yang berbeda, terdapat beberapa overlap pada spektrum emisi antara keempat dye (lihat gambar 12). Tujuan multicomponent analysis adalah mengisolasi signal dari setiap dye sehingga noise pada data menjadi sesedikit mungkin.
| [simage=30,200,n,left] |
| Gambar 12: Multicomponent Analysis |
10. Apakah De Novo Sequencing itu?
Proses eksperimental penentuan urutan basa nukleotida suatu daerah (region) DNA dengan melabel setiap nukleotida dengan penanda fluorescent untuk mengidentifikasinya.
11. Apakah yang dimaksud dengan Multi-Locus Sequence Typing (MLST)?
MLST adalah suatu prosedur yang tidak ambigu untuk mengkarakterisasi isolat bakteri menggunakan sekuen fragmen internal dari 7 gen housekeeping. Prosedur ini menggunakan fragmen internal (~450-500 bp) dari setiap gen, sehingga mereka dapat disekuen pada kedua utasnya secara akurat dengan mesin DNA sequencer terotomatisasi. Untuk setiap gen housekeeping, sekuen-sekuen yang terdapat dalam suatu spesies bakteri dinyatakan sebagai alel yang jelas, dan untuk setiap isolat, alel pada masing-masing ketujuh loci mendefinisikan profice allelic atau jenis sekuen (IST)
12. Apakah yang dimaksud dengan Deteksi berbasis SNP atau Resequencing?
Sebuah heterozygote mengandung alel-alel yang berbeda pada suatu locus (posisi) pada kromosom homolog. Deteksi heterozygote dilakukan dengan primer spesifik.
13. Apakah HLA Typing itu?
Pengujian human leukocyte antigen (HLA) mendeteksi antigen-antigen (penanda genetik) pada sel darah putih. Terdapat 4 jenis human leukocyte antigens yaitu: HLAA, HLAB, HLAC, dan HLAD. Tes HLA menguji kompatibilitas jaringan dan penentuan jenis jaringan reseptor/donor. Tes ini juga digunakan pada konseling genetik dan pengujian paternitas. (hanya untuk riset.)
14.apakah Deteksi Metilasi itu?
Metilasi DNA terjadi pada situs CpG, yang mana sekuen DNA dengan sitosin berada dekat dengan guanin. Metilasi dimediasi oleh suatu enzim (DNA methyltransferase). Situs CpG jarang terdapat pada genom eukariot, kecuali pada wilayah yang dekat dengan promoter suatu gen eukariotik. Wilayah ini dikenal sebagai CpG islands, dan keadaan metilasi pada situs-situs CpG penting bagi aktifitas/ekspresi gen.
15. Apakah mtDNA sequencing itu?
mtDNA adalah kependekan dari mitokondria. Molekul mitokondrial terdapat dalam jumlah 100-1000 salinan per sel, lain dengan DNA inti yang terdapat hanya dua salinan per sel. Banyaknya mtDNA memungkinkan diskriminasi antara individu-individu atau sampel-sampel biologis, khususnya jika DNA inti rusak atau tidak tersedia.
16. Apakah yang dimaksud dengan Comparative Genomic Resequencing?
Comparative Genomic Resequencing adalah perbandingan genom-genom dan individu-individu dalam suatu genom. Comparative genomics memungkinkan aplikasi informasi yang diperoleh dari suatu genom sampel menjadi suatu genom yang lebih kompleks. Ini merupakan dasar untuk memahami variasi genetik dalam suatu populasi.
17. Apakah Deteksi Mutasi Non-SNP itu?
Mutasi deteksi Non-SNP adalah suatu Resequencing dimana perbandingan suatu sekuen dengan suatu sekuen referensi dilakukan menggunakan mutasi-mutasi Non-SNP, seperti insersi dan delesi.
18. Apakah Metode SAGE™ itu?
SAGE™ adalah sebuah motede untuk analisa kuantitatif, pola ekspresi gen pada genome. Suatu tag sekuen pendek (10 – 25 bp) mengandung informasi yang cukup untuk mengidentifikasi suatu transkrip.
19. Apakah yang dimaksud dengan profiling mutasi menggunakan analisa, deteksi atau validasi SNP itu?
Sebuah single nucleotide polymorphism (SNP) adalah substitusi satu basa atas yang lainnya. Beberapa metode berbasis sequencing tersedia untuk pencarian dan analisa SNP.
Diterjemahkan dengan modifikasi dari situs www.appliedbiosystems.com
Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life science yang melibatkan analisa ini. Pencapaian terbesar teknologi DNA sequencing saat ini adalah terungkapnya urutan basa nukleotida yang menyusun genom manusia. Para peneliti yang menggunakan tools ini seringkali menghadapi masalah dalam melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak memuaskan. DNA sequencing menggunakan elektrophoresis kapiler merupakan teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science. Berikut ini adalah beberapa hal yang penting untuk diketahui yang menjadi faktor penentu keberhasilan analisa DNA Sequencing.
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample.
Urutan kerja DNA sequencing secara umum mengharuskan kita mengamplifikasi hasil ekstraksi DNA sample sebelum disekuen. Untuk mengamplifikasi DNA sample, kita membutuhkan DNA polymerase, nukleotida (dNTP), buffer reaksi, primer dan sebuah thermal cycler.
Cycle sequencing merupakan metode sederhana yang mana terdiri atas proses denaturasi, annealing dan ekstensi yang berulang-ulang dalam sebuah mesin thermal cycler, menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi. Produk ini kemudian diinjeksikan ke dalam sebuah kapiler. Untuk Applied Biosystems, ada 2 kategori pendekatan sequencing chemistry: Dye Primer Chemistry dan Dye Terminator chemistry.
| [simage=17,200,n,left] |
| Gambar 1: Cycle Sequencing |
![Bakteri purba dari sedimen sub-permukaan [image from: the-scientist.com]](http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2012/05/20120523-074119-60x33.jpg "Bakteri purba dari sedimen sub-permukaan [image from: the-scientist.com]"){kind=small}
