Perangkat PAGE Vertikal (image from uniequip.com)
Sampai saat ini kita telah melihat masalah yang timbul selama proses persiapan dan running SDS-PAGE. Kali ini kita akan melihat dan membagikan solusi atas masalah yang biasa muncul saat proses sesudah running terutama saat proses pewarnaan hasil elektroforesis.
Perangkat PAGE Vertikal (image from uniequip.com)
Memang banyak sekali faktor yang bisa mempengaruhi keberhasilan SDS-PAGE. Pada artikel bagian pertama kita sudah membahas beberapa masalah yang sering terjadi dan pemecahannya. Sekarang kita akan melanjutkan pembahasan beberapa masalah yang biasa muncul saat menjalankan SDS-PAGE dan solusi mengatasinya.
+Continue Reading
Perangkat PAGE Vertikal (image from uniequip.com)
Sebelumnya telah diberikan beberapa tips dan trik yang dapat mempermudah pengerjaan SDS-PAGE namun tentunya masalah bisa datang tanpa ada yang tahu. Apakah hasil yang buruk, proses SDS-PAGE yang terganggu, atau kerusakan di gel, banyak sekali hal yang dapat memperlambat dan mengganggu proses pengumpulan data kita. Dalam artikel kali ini akan dibahas troubleshooting untuk beberapa masalah yang umum ditemukan pada proses SDS-PAGE. Semoga dapat membantu!
SDS PAGE
Tidak seperti elektroforesis agarose yang persiapannya cukup sederhana, banyak peneliti menemukan masalah saat akan melakukan persiapan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Bahan yang berbahaya, proses pembuatan yang memakan waktu, sampai berbagai macam resiko seperti kebocoran dan gel yang tidak membeku menyebabkan SDS-PAGE sering dikatakan ‘merepotkan’. Beberapa cukup beruntung dapat menggunakan gel pre-set namun masih banyak dari kita yang harus menyiapkan dari nol. Di website ini telah dibahas cara mencegah kebocoran SDS-PAGE dan kali ini akan dipaparkan tips dan trik dalam menjalankan SDS-PAGE untuk meminimalisir kesalahan dan meningkatkan kualitas hasil yang didapat. +Continue Reading
Analisis ukuran protein dengan SDS-PAGE (image from piercenet.com)
SDS-PAGE atau Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis adalah teknik sederhana yang umum digunakan untuk menganalisa ukuran protein. Bagi Anda yang pernah melakukannya tentu tahu bahwa salah satu tahapan kritis analisa ini adalah pada saat pembuatan gel SDS-PAGE-nya, kurang cermat bisa menyebabkan kebocoran sehingga gel yang terbentuk tidak sempurna. Nah, bagaimana cara mengatasi kebocoran ini? +Continue Reading
Gel Electrophoresis; image from http://clearlyexplained.com/culture/health/electrophoresisgel.jpg
Saat ini, teknik pemisahan dan pemurnian DNA/RNA merupakan teknik yang tidak dapat dipisahkan dari biologi molekular. Hampir semua penelitian DNA/RNA mesti melibatkan pemisahan dan pemurnian yang tekniknya cukup beragam. Elektroforesis adalah salah satu teknik pemisahan paling populer, maka tak heran jika elektroforesis disebut sebagai pintu gerbang dari berbagai penelitian biologi molekular. Nah, sekarang ada baiknya kita telusuri dulu teknik-teknik tersebut dari masa ke masa.
Oh ya, pada prinsipnya elektroforesis itu adalah teknik pemisahan campuran molekul yang didasarkan pada perbedaan muatan listriknya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fasa diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda.
[simage=233,160,y,right]
Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Bagaimana keduanya bisa mengungkap rahasia ini?
[simage=232,200,y,left]
Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu mereka namakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.
Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, mereka dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.
[simage=234,200,y,left]
Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu.
Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida. Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.
[simage=236,200,y,left]
Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar.
Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.
[simage=235,200,y,left]
Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor membeberkan ide cerdasnya untuk memisahkan campuran DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada patogen.
Keempat teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian lainnya dalam bidang biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit dibayangkan sebuah laboratorium biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA yang sedang kita teliti akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan, sulit pula membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis selain dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun sangat bergantung pada teknik elektroforesis ini. Terima kasih kepada Markham dan Smith yang telah mencoba meneteskan RNA hidrolisat pada selembar kertas saring dan memisahkannya dengan arus listrik.
Sumber:
![Bakteri purba dari sedimen sub-permukaan [image from: the-scientist.com]](http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2012/05/20120523-074119-60x33.jpg "Bakteri purba dari sedimen sub-permukaan [image from: the-scientist.com]"){kind=small}
