Archive for the ‘BioTechnique’ Category
Butanediol Molecule (image from invista.com)
Kontributor:
Megahwaty Effendy | Yurike Laurensia | Delia Agustina
(Fakultas Teknobiologi Unika Atmajaya Jakarta)
Siapa tidak mengenal bakteri Escherichia coli? Bakteri ini pertama kali ditemukan oleh Theodor Escherich pada tahun 1885. Bakteri ini sangat akrab dalam kehidupan manusia karena bakteri ini merupakan salah satu penghuni saluran pencernaan manusia. Meskipun begitu, tetap saja ada beberapa strain E. coli yang bersifat patogen, seperti Escherichia coli yang dapat menyebabkan diare berdarah. Tetapi, tidak semua strain E. coli merupakan patogen, E. coli juga banyak dimanfaatkan dalam bidang bioteknologi. Dalam artian luas, bioteknologi itu merupakan suatu cabang ilmu yang menggunakan sumber hayati untuk menghasilkan sesuatu yang dapat berguna bagi kebutuhan manusia. Di era modern ini, bioteknologi banyak digunakan untuk melakukan teknik rekayasa genetika, yaitu suatu teknik yang dilakukan untuk merubah susunan gen tertentu dari suatu organisme untuk berbagai macam kepentingan.
+Continue Reading
Bakteri hasil kloning yang dapat berpendar (image from speakscience.org)
Melakukan klon suatu produk PCR (insert) ke plasmid dapat dilakukan dengan beberapa cara, bisa melalui TA cloning maupun dengan bantuan enzim restriksi. Namun seringkali situs enzim restriksi pada insert tidak cucok alias compatible dengan situs pada plasmid, sehingga perlu suatu cara untuk menambahkan situs enzim restriksi pada produk PCR agar bisa diklon dengan baik. Untuk itu kita perlu bantuan adapter.
Adapter yang dimaksud di sini adalah primer PCR biasa yang ditambahkan beberapa nukleotida pada bagian depannya (ujung 5′) yang membentuk situs enzim restriksi yang diinginkan. +Continue Reading
Analisis ukuran protein dengan SDS-PAGE (image from piercenet.com)
SDS-PAGE atau Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis adalah teknik sederhana yang umum digunakan untuk menganalisa ukuran protein. Bagi Anda yang pernah melakukannya tentu tahu bahwa salah satu tahapan kritis analisa ini adalah pada saat pembuatan gel SDS-PAGE-nya, kurang cermat bisa menyebabkan kebocoran sehingga gel yang terbentuk tidak sempurna. Nah, bagaimana cara mengatasi kebocoran ini? +Continue Reading
Cloning is Dead. Now Gene Synthesis Era (image from mrgene.com)
Teknologi rekayasa genetika kini sudah semakin canggih, kalau dulu rekayasa dilakukan dengan memindahkan gen dari satu organisme ke organisme lainnya dengan teknik kloning, maka sekarang gen sudah bisa disintesis secara artifisial di laboratorium. Bahkan banyak perusahaan yang menawarkan jasa sintesis gen ini dengan harga relatif murah. Mau tau bagaimana cara sintesis gen? +Continue Reading
Bacterial Transformation (Image from gbiosciences.com)
Para ilmuwan rekayasa genetika gemar melakukan eksperimen dengan ‘menggunting’, ‘menyambung’ dan ‘menempelkan’ fragmen-fragmen DNA, kemudian memasukkannya ke dalam sel makhluk hidup seperti bakteri, fungi, tanaman dan juga hewan untuk dilihat bagaimana efek dari DNA yang dimasukkannya itu. Lantas bagaimana caranya agar suatu fragmen DNA dapat dimasukkan ke dalam sel makhluk hidup dan dapat berfungsi layaknya DNA milik sel itu sendiri?
Sebelum menjawab pertanyaan tersebut, kita kilas balik sejenak ke tahun 1928 ketika Frederick Griffith sedang mencari vaksin untuk melawan bakteri penyebab pneumonia yaitu Streptococcus pneumoniae. Saat itu ia dibuat heran ketika strain bakteri S. pneumoniae yang tidak virulen dapat berubah menjadi virulen setelah kontak dengan strain yang virulen yang sudah mati. Kok bisa? apa yang menyebabkan perubahan itu? +Continue Reading
TA Cloning Diagram (Picture from wikimedia.org)
Produk PCR dapat diklon ke suatu vektor melalui “permainan gunting dan lem DNA” seperti yang pernah kami bahas sebelumnya. Ada beberapa pendekatan yang dapat dilakukan, yaitu melalui “blunt end” cloning, “TA” cloning dan “sticky end” cloning. Cara mana yang harus kita pilih? Yuk kita lihat apa untung rugi ketiga cara tersebut. +Continue Reading
Multichannel Pipet (Image from ic.daad.de)
Bekerja di laboratorium tentu tidak akan terlepas dari urusan ukur-mengukur. Untuk sampel padatan, kita akan berurusan dengan neraca analitik, sementara untuk sampel cairan, pipet volumetrik-lah andalannya. Akurasi dan presisi pemipetan merupakan faktor utama keberhasilan analisa atau percobaan yang melibatkan cairan. Pipet sudah digunakan sejak abad ke-19 oleh Louis Pasteur (1822-1895) dan kini jenis pipet sudah berkembang luas dengan tingkat akurasi dan presisi yang bermacam-macam pula. +Continue Reading
DNA atau Deoxyribonucleic Acid yang merupakan sandi genetik makhluk hidup ternyata dapat dijadikan bahan ‘permainan’ gunting dan tempel. Ya, ini serius lho. Para ahli rekayasa genetika kerapkali melakukan ‘permainan’ ini untuk memperoleh susunan DNA yang diinginkan dan memiliki fungsi tertentu. Istilah kerennya Rekayasa Genetika.
Contoh paling terkenal adalah yang terjadi pada gen insulin dari pankreas manusia yang dengan ‘permainan’ ini dapat dimasukkan ke dalam sel bakteri –seperti E. coli– atau tumbuhan –seperti safflower– dan diekspresikan di dalamnya sehingga saat ini kita dapat memperoleh insulin (obat diabetes) tanpa harus mengekstraknya langsung dari sapi atau babi, cukup dengan menumbuhkan bakteri atau tanaman hasil rekayasa genetika yang memiliki gen insulin dan memanen insulin darinya.
Bagaimana ‘permainan’ ini dilakukan?
DNA ligase memperbaiki kerusakan kromosom. (Image from wikipedia.org)
Kita harus berterima kasih kepada para bakteri dan archaea karena umumnya mereka memiliki ‘gunting’ berupa enzim yang dapat memotong-motong DNA secara spesifik. Enzim ini berguna sebagai bentuk pertahanan bakteri terhadap DNA-DNA asing yang masuk ke dalam sel bakteri. DNA asing ini akan dipotong-potong agar tidak akan membahayakan bakteri lagi oleh enzim yang disebut ‘Restriction Endonuclease‘ (sering disebut enzim restriksi). DNA si bakteri sendiri sudah terlindungi dengan mekanisme tertentu (metilasi) sehingga akan terhindar dari pemotongan. Suatu sistem pertahanan yang sangat cerdas untuk makhluk sekelas bakteri.
Sedangkan ‘lem’ DNA secara alami terdapat baik pada eukaryota maupun prokaryota. Secara komersial, enzim ini diperoleh dari virus tertentu seperti bakteriofage T4 yang memiliki enzim ligase yang dapat menyambungkan gugus -OH pada suatu utas DNA dengan gugus -PO4 pada utas lainnya membentuk ikatan phosphodiester. Enzim ini pada dasarnya berfungsi untuk memperbaiki kerusakan-kerusakan pada kromosom.
Nah, para ilmuwan rekayasa genetika telah berhasil mengisolasi ratusan jenis ‘gunting’ untuk memotong-motong DNA dan ‘lem’ DNA untuk menyambungkan kembali hasil potongan tersebut sehingga diperoleh DNA dengan susunan tertentu.
Restriction Endonuclease
DNA tersusun atas empat basa nukleotoda yaitu A (adenine), G (guanine), C (cytosine) dan T (thymine). –Lihat kembali artikel tentang DNA di sini. Enzim restriksi (dalam hal ini adalah Restriction Endonuclease Type II) alias ‘gunting’ DNA hanya akan memotong DNA pada tempat tertentu saja, yaitu jika ia menemukan susunan palindrom, urutan basa yang jika dibaca dari kedua utas DNA akan tetap sama. Perhatikan contoh sekuen berikut ini:
5'-GATATC-3'
::::::
3'-CTATAG-5'
Baik di utas atas maupun bawah memiliki sekuen yang sama bukan (dibaca dari 5′ ke 3′)? Nah, di sekuen palindrom seperti itulah enzim restriksi akan bekerja.
Setiap enzim restriksi hanya dapat memotong pada susunan palindrom tertentu. Misalnya enzim EcoRI akan bekerja jika menemukan urutan GAATTC, enzim SmaI pada urutan CCCGGG, enzim AluI pada urutan AGCT, dan seterusnya.
Cara pemotongan DNA pun tidak sembarangan, masing-masing enzim punya titik pemotongan tertentu yang khas. Misalnya BamHI yang mengenali situ GGATCC akan memotong pada posisi antara dua G membentuk fragmen yang ujungnya ada yang tidak berpasangan (cohesive atau sticky ends).
5'-G GATCC-3'
: :
3'-CCTAG G-5'
Sedangkan enzim PovII yang mengenali situs CAGCTG akan memotong di tengah situs pemotongan membentuk fragment yang semua ujungnya berpasangan (blunt ends):
5'-GGA TCC-3'
::: :::
3'-CCT AGG-5'
Ada sekitar 600 enzim restriksi yang tersedia secara komersial saat ini. Berikut ini beberapa contoh enzim restriksi beserta situs pemotongannya.
List of Restriction Enzyme (Image from ncbi.nlm.nih.gov)
Situs Pengenalan dan Pemotongan Enzim Restriksi (Image from ncbi.nlm.nih.gov)
Penamaan Enzim Restriksi
Kalau diperhatikan, nama enzim restriksi ini keren-keren juga. Ternyata ada maksudnya lho, begini aturannya:
- Huruf pertama adalah singkatan nama genus bakteri pemilik enzim tersebut
- Huruf kedua dan ketiga adalah singkatan nama spesies bakteri.
- Huruf keempat adalah dingkatan nama Strain.
- Huruf kelima adalah urutan penemuan enzim tersebut.
Misalnya EcoRI berasal dari Escherichia coli strain RY13 yang pertama kali diidentifikasi, HindIII dari Haemophilus influenzae, dan lain-lain.
Bagaimana ‘Lem’ DNA Bekerja?
Enzim DNA ligase bekerja dengan menyambungkan utas DNA yang memiliki ujung 5′-PO4 dengan ujung 3′-OH pada utas lain. Mekanismenya bisa bermacam-macam, misalnya:
Ligation of Sticky Ends DNA (Image from wikipedia.org)
- Menyambungkan utas-utas DNA yang sama-sama memiliki ujung overhang hasil pemotongan enzim restriksi. Ujung overhang ini harus saling komplemen agar dapat menempel dengan baik. Ujung overhang pada utas sense akan berpasangan dengan ujung overhang utas antisense. Lalu DNA Ligase tinggal membentuk ikatan phosphodiester sehingga kedua utas kini sudah menjadi satu dengan ikatan yang sangat kuat. Mekanisme ini cenderung lebih mudah karena kedua ujung overhang dapat menempel lebih dulu karena memiliki sekuen yang saling komplemen.
Ligation of Blunt Ends DNA (Image from wikipedia.org with modification)
- Menyambungkan utas-utas DNA yang sama-sama memiliki ujung blunt hasil pemotongan enzim restriksi atau hasil blunt PCR. DNA dengan ujung blunt lebih sulit untuk ‘dilem’ dengan enzim DNA Ligase karena tidak ada ujung overhang yang membantu kedua utas untuk saling menempel terlebih dulu sebelum ‘dilem’
Beberapa Sifat Khusus Enzim Restriksi
Isochizomer
Isochizomer adalah enzim-enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan yang sama. Hasil pemotongannya bisa sama dan bisa juga berbeda. Misalnya HpaII (situs pengenalan: C↓CGG) dan MspI (situs pengenalan: C↓CGG) adalah isoschizomer, begitu pula AatI (AGG↓CCT) dan StuI (AGG↓CCT).
Neoschizomer
Neoschizomer adalah bagian dari isoschizomer, memiliki situs pengenalan yang sama tetapi memotong pada tempat yang berbeda sehingga hasil pemotongannya pun berbeda. Misalnya AatII (situs pengenalan: GACGT↓C) dan ZraI (situs pengenalan: GAC↓GTC).
Tabel yang berisi daftar isoschizomer dan neoschizomer dapat ditemukan di situs NEB (New England Biolabs).
Kompatibilitas Ujung Overhang
Ada beberapa enzim restriksi yang memiliki situs pengenalan berbeda tetapi hasil pemotongannya memiliki ujung overhang yang sama. Misalnya AccIII (T↓CCGGA) dengan AgeI (A↓CCGGT) yang menghasilkan ujung overhang CCGG.
Sifat ini sangat penting dalam aspek rekayasa genetika, terutama bila fragmen DNA yang akan kita klon memiliki situs pengenalan enzim restriksi yang berbeda dengan vektornya. Asalkan hasil pemotongan memiliki ujung overhang yang sama maka proses ligasi dapat dilakukan kemudian.
Aplikasi ‘Gunting’ dan ‘Lem’
Nah, dengan menggunakan bantuan kedua jenis enzim ini, para ilmuwan rekayasa genetika bisa mengutak-atik DNA untuk keperluan tertentu seperti rekombinasi DNA yang menghasilkan DNA rekombinan. Secara garis besar berikut adalah proses yang terjadi:
Cloning gene of interest into plasmid (Image from bio.davidson.edu)
Masih banyak aplikasi lain dari enzim restriksi dan DNA ligase, kita akan coba bahas dalam artikel lain. Jangan lupa memberikan komentar untuk kami.
Mana yang lebih baik untuk melarutkan DNA/RNA? TE Buffer atau ddH2O? Pertanyaan ini seringkali muncul dan menjadi bahan diskusi yang menarik. Dan ternyata masing-masing memiliki kelebihan dan kelemahan sehingga pelarut mana yang dipilih amat bergantung pada tujuan kita melarutkan DNA/RNA.
DNA Precipitate | Image from http://www.biotechlearn.org.nz/
TE Buffer
TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. Berikut ini resep pembuatannya:
Larutan Tris-HCl 1 M pH 7.5
Untuk membuat 1 L larutan:
- Tambahkan 121.14 g Tris Base (BM = 121.14 g/mol) ke dalam 800 mL ddH2O
- Atur pH hingga mencapai pH 8.0 dengan larutan HCl 4N
- Tambahkan ddH2O hingga volumenya tepat 1 L
Catatan: Nama kimia dan nama lain dari Tris base adalah 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol, THAM, Tris(hydroxymethyl)aminomethane, atau Trometamol
Larutan EDTA 500 mM pH 8.0
Untuk membuat 1 L larutan:
- Tambahkan 186,12 g Sodium EDTA dihydrate (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) atau 146.12 g EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) ke dalam 800 mL ddH2O
- Atur pH hingga mencapai pH 8.0 dengan larutan NaOH 4 N
- Tambahkan ddH2O hingga volumenya tepat 1 L
Untuk membuat 1 L larutan Stok TE Buffer 10X, campurkan larutan-larutan berikut ini:
- 100 ml Tris-HCl 1 M pH 7.5
- 20 ml EDTA 500 mM pH 8.0
- 880 ml ddH2O
Larutan diaduk hingga bercampur sempurna.
Larutan TE Buffer dapat disterilkan menggunakan autoclave.
ddH2O
ddH2O atau disebut juga aqua bidestillata atau ultrapure water, adalah air yang sangat murni, lebih murni dari aquadest atau pun air reverse osmosis karena telah melalui berbagai macam cara pemurnian. Pada awalnya orang melakukan destilasi kembali pada air yang telah didestilasi, namun saat ini digunakan kombinasi berbagai jenis pemurnian untuk memperoleh ultrapure water ini (Artikel tentang tingkat kemurnian air dapat dilihat selengkapnya di sini).
Secara umum ddH2O dibuat dengan melewatkan aquadest ke dalam suatu cartridge berisi resin-resin filter dan deionisasi untuk menghilangkan ion-ion dari air, hingga diperoleh nilai hantaran listrik yang sangat kecil (sekitar 5.5 × 10−6 S·m−1 atau 18 MΩ cm), terakhir air tersebut dilewatkan melalui filter membran dengan pori-pori 0.22 µl. Biasanya ddH2O tidak perlu disterilkan lagi menggunakan autoclave.
Mana yang Lebih Baik?
Kedua pelarut di atas paling umum digunakan untuk melarutkan DNA atau RNA, karena keduanya dapat melarutkan DNA atau RNA dengan baik. Namun untuk alasan stabilitas dan tujuan pemakaian DNA atau RNA, maka keduanya memiliki keunggulan dan kelemahan masing-masing.
DNA atau RNA akan lebih stabil jika dilarutkan dalam TE buffer karena pH-nya djaga sekitar 8. Ingat bahwa fungsi utama buffer adalah menyangga pH pada nilai tertentu. Jika dilarutkan dalam ddH2O, ada peluang untuk berubahnya pH. Ini dapat terjadi karena DNA dan RNA memiliki sifat asam lemah (ingat: DNA=asam deoksiribonukleat, RNA=asam ribonukleat), yang dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi DNA/RNA, apalagi DNase juga bekerja pada pH yang sedikit asam. Jadi untuk alasan kestabilan, buffer TE lebih unggul dibanding ddH2O.
Meskipun TE buffer membuat stabil DNA, tapi kita harus berhati-hati jika DNA atau RNA tersebut akan digunakan untuk aplikasi enzimatis seperti PCR (Polymerase Chain Reaction). Kenapa begitu? Karena TE buffer mengandung EDTA, yang dapat membentuk senyawaan kompleks dengan ion logam seperti Mg2+. Dalam hal ini EDTA merupakan chelating agent. Padahal Mg2+ adalah prekursor untuk enzim Taq DNA polymerase yang digunakan pada reaksi PCR, jadi kalau jumlah EDTA pada larutan DNA atau RNA cukup banyak, bisa menyebabkan reaksi PCR menjadi terhambat karena enzim DNA polymerase-nya tidak dapat bekerja secara sempurna. Jadi utk alasan ini, ddH2O lebih unggul dibanding TE buffer karena ddH2O tidak mengandung chelating agent.
Jadi, aplikasi lanjutan dari sampel DNA atau RNA akan menentukan pilihan kita. Jika DNA atau RNA akan segera digunakan untuk aplikasi PCR, lebih baik menggunakan ddH2O sebagai pelarut. Jika bukan dan akan disimpan dalam waktu yang cukup lama, TE buffer lah pilihannya. Tapi bisa saja kita mengakalinya dengan mengganti TE buffer dengan Tris-HCl buffer pH 8 karena tidak mengandung EDTA. Larutan Tris-HCl buffer ini sering digunakan sebagai elution buffer pada kit-kit purifikasi DNA/RNA komersial.
Satu hal lagi yang harus diingat, TE buffer atau ddH2O yang digunakan untuk melarutkan RNA harus bebas RNase, yaitu yang sudah di-treatment dengan DEPC (Diethyl Pyrocarbonate).
Selain itu, faktor penyimpanan juga sangat berpengaruh terhadap kestabilan larutan DNA atau RNA. Hal-hal berikut harus diperhatikan:
- Simpanlah larutan DNA atau RNA pada suhu -20oC atau -80oC (untuk RNA)
- Jangan sering-sering melakukan freeze-thaw, lebih baik melakukan aliquot dengan membagi larutan DNA atau RNA ke dalam beberapa tabung dengan volume lebih kecil.
So, apakah ada argumen lain yang bisa diungkapkan? Silakan tinggalkan komentar untuk kami.
RT PCR alias Reverse Transcriptase PCR adalah teknik yang digunakan untuk membuat cDNA (complementary DNA) dengan RNA sebagai template-nya. Proses ini adalah kebalikan dari transkripsi DNA menjadi RNA yang umum terjadi pada makhluk hidup, sehingga dinamakan reverse transcription (transkripsi terbalik). Di alam proses ini hanya terjadi pada virus-virus tertentu ketika menyusupkan materi genetiknya yang berupa RNA ke dalam genom ‘korbannya’. (Lihat kembali mengenai ‘Central Dogma in Molecular Biology‘).
HIV, salah satu virus yang memiliki enzim Reverse Transcriptase | Image from www.vircolab.com
Catatan: Jangan keliru dengan istilah realtime PCR yang juga sering disingkat RT PCR. Yang kita bahas di sini adalah Reverse Transcriptase PCR. Untuk membedakan biasanya istilah realtime PCR diganti dengan quantitative PCR (qPCR).
Di laboratorium, RT PCR umumnya dilakukan untuk menganalisa tingkat ekspresi genetik. Karena ekspresi setiap gen berbeda-beda, maka proses RT PCR harus dilakukan secara efisien dan tidak boleh melewatkan RNA dari gen yang tergolong ‘low copy’ dan sulit.
Berikut ini adalah beberapa tips yang mungkin dapat membantu:
Pemilihan primer RT
Ada 3 pilihan primer, oligo dT, random primer atau primer spesifik gen. Banyak orang menggunakan oligo dT karena mereka bisa mendapatkan salinan cDNA lengkap dari full mRNA.
Akan tetapi, jika mRNA-nya panjang (>4 kb) atau tidak memiliki ekor poly A (mRNA prokaryota), maka pilihannya adalah random primer. Dengan random primer, ujung 5′ gen-gen yang panjang dapat ditranskripsi balik, tetapi cDNA yang diperoleh mungkin tidak full dari seluruh gen. Biasanya digunakan random primer 6-mers, tetapi 8 atau 9-mers dapat meningkatkan ukuran cDNA karena primernya akan terhibridisasi lebih jarang.
Untuk aplikasi qPCR (quantitative PCR) gen-gen eukaryota, hasil terbaik bisa diperoleh dengan menggunakan kombinasi random primer panjang dan oligo dT.
Pilihan ketiga adalah primer spesifik gen yang dapat meningkatkan sensitivitas dengan mengarahkan seluruh aktifitas enzim RT untuk mentranskripsi balik hanya RNA tertentu saja. Jika yang kita lakukan adalah one-step RT PCR, primer spesifik gen digunakan karena primer RT juga nantinya digunakan sebagai primer reverse pada reaksi PCR-nya.
Struktur Sekunder RNA
Struktur sekunder ini bisa jadi masalah dalam transkripsi balik RNA secara utuh. Ibarat menemui jalan buntu, enzim RT dapat berhenti ketika menemui struktur sekunder pada RNA-nya.
Sulit memang memprediksi apakah RNA kita akan memiliki struktur sekunder, tapi biasanya kandungan GC yang tinggi bisa kita jadikan indikator bahwa RNA akan sulit untuk memisah dan mungkin tidak akan benar-benar menjadi utas tunggal sebelum reaksi. Untuk mengatasinya, bisa dengan melakukan denaturasi dulu pada suhu 65C selama 5 menit sebelum reaksi RT agar RNA-nya dalam keadaan rileks.
Pendekatan lainnya adalah dengan menggunakan enzim RT yang dapat bekerja pada suhu yang lebih tinggi dari RT standar. Ada juga enzim RT yang mampu menembus struktur sekunder RNA meski dilakukan pada suhu RT standar.
Menyingkirkan gDNA
Kontaminasi DNA genom (gDNA) pada RNA merupakan salah satu penyebab terjadinya false positif saat reaksi PCR nantinya. Ada beberapa cara untuk menyingkirkan gDNA, misalnya pemberian DNase selama proses atau setelah isolasi RNA.
Jika sample RNA diisolasi dari sel eukaryota, maka cara terbaik menghindari kontaminasi gDNA ketika PCR adalah dengan mendesain primer yang menyeberangi intron atau batas intron-exon. Seperti kita tahu bahwa mRNA pada eukaryota merupakan hasil transkripsi dari exon pada gDNA tanpa diseling-selingi lagi oleh intron-intron. Dengan cara ini tidak akan terjadi amplifikasi terhadap gDNA (atau setidaknya akan memiliki produk PCR yang berbeda ukurannya).
Satu hal yang harus diwaspadai adalah pseudogene, yaitu salinan dari mRNA hasil splicing yang diinsersikan ke dalam genom. Primer yang didesain hanya untuk mRNA tadi tetap akan mengamplifikasi pseudogene ini.
Untuk mRNA prokaryota masalah tidak akan selesai dengan primer yang didesain menyeberangi intron karena gDNA prokaryota tidak memiliki intron, sehingga penyingkiran gDNA ini amat krusial untuk keakuratan pengukuran ekspresi gen. Satu-satunya pilihan adalah reaksi enzimatik selama proses isolasi mRNA seperti yang diuraikan di atas. Harus dipastikan pula bahwa gDNA benar-benar tidak mengganggu amplifikasi, misalnya dengan buffer-buffer tertentu penghilang sisa-sisa DNA atau dengan mengamplifikasi (PCR) langsung RNA hasil isolasi tanpa melalui proses RT PCR. Jika amplifikasi PCR tetap terjadi berarti gDNA masih bercokol di situ.
Memeriksa RNA Integrity
Kualitas RNA amat berpengaruh terhadap hasil sintesa cDNA. Variasi kualitas RNA dari batch-ke-batch dapat menyebabkan hasil yang tidak konsisten. Sebelum melakukan reaksi RT PCR, kita harus memeriksa kualitas band rRNA dengan melarikannya pada gel agarose dan memeriksanya secara visual. RNA eukaryota yang masih utuh (intact) ditunjukkan dengan adanya dua band rRNA 28s dan 18s yang jelas dengan intensitas pita 28s (lebih besar) kira-kira 2 kali intensitas pita 18s (lebih kecil). Jika intensitasnya sama pun masih bisa dianggap bagus.
Jangan gunakan RNA yang memiliki smear tebal di sekitar pita rRNA apalagi pada bagian bawah untuk reaksi RT PCR. Karena jika demikian sample RNA tersebut telah terdegradasi.
Cara yang lebih akurat dan hemat sample adalah menggunakan Agilent BioAnalyzer untuk menentukan kualitas RNA secara lebih akurat. Selain menampilkan visualisasi pita-pita RNA dalam bentuk grafik, juga dapat menghitung RNA Integrity Number (RIN) secara kuantitatif. Skor RIN sempurna adalah 10, RIN 8 tetap OK, dan jika sudah di bawah 7 maka artinya sample RNA kita sudah terdegradasi dan akan menyebabkan hasil yang tidak konsisten. Cara ini memang lebih mahal tetapi hasil yang diberikan sangat akurat, terlebih jika sample RNA akan digunakan untuk analisa ekspresi seperti microarrays.
Pengukuran Kuantitas RNA
Selain keutuhan RNA, kuantitas hasil isolasi RNA pun penting untuk diketahui. Akurasi hasil pengukuran dapat dipengaruhi beberapa faktor seperti akurasi instrumen yang digunakan, kontaminasi DNA, garam-garam, dan juga tingkat degradasi RNA. Untuk pengukuran kuantitas RNA, spektrofotometer Nanodrop adalah alat yang digemari karena kemudahan dan akurasinya, disamping itu jumlah sampel yang diperlukan hanya 1 uL saja sehingga sangat menghemat sampel RNA yang sangat berharga untuk penelitian selanjutnya.
Kelemahan instrumen spektrofotometer UV untuk pengukuran RNA adalah bahwa DNA genom dan garam-garam yang mengkontaminasi akan terukur juga absorbansinya bersama dengan RNA sehingga akan menyebabkan false positive. Untuk itu dikembangkan suatu teknik pewarnaan spesifik RNA menggunakan Ribogreen, jadi yang diukur absorbansinya adalah Ribogreen yang terikat pada RNA sehingga hasil pengukuran akan lebih akurat.
One Step RT-PCR atau Two Step RT-PCR?
Pada one step RT-PCR, reaksi transkripsi balik untuk mengkonversi RNA menjadi cDNA dan reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen tertentu yang ingin kita ketahui ekspresinya dilakukan dalam satu rangkaian reaksi dan dalam satu tabung reaksi yang sama. Sedangkan pada two step RT-PCR, reaksi transkripsi balik dan reaksi PCR dilakukan secara terpisah dan melibatkan beberapa tabung reaksi.
Masing-masing cara memiliki keunggulan dan kelemahan, dan pilihannya amat bergantung pada penelitian yang kita lakukan. Dengan one step RT-PCR, tidak ada proses transfer sample sehingga mengurangi sumber kontaminasi, dan karena digunakan primer spesifik untuk RT-PCR dan PCR, maka sensitifitasnya bisa lebih baik. Dengan two step RT-PCR, RNA dapat dikonversi menjadi cDNA dalam jumlah besar sekaligus, baru kemudian dialiquot untuk digunakan pada analisis beberapa gen berbeda. Ini dapat mengurangi variasi ketika membandingkan ekspresi beberapa gen dari sumber yang sama. Pilihan primer pun beragam, bisa oligo dT, random primer atau primer spesifik gen. Jadi, pilihannya bergantung kebutuhan riset kita.
Karena banyak faktor yang mempengaruhi kesuksesannya, maka alangkah baiknya kita merancang metode RT-PCR ini dengan lebih baik, dan kondisi yang optimum bisa saja bervariasi dari satu penelitian ke penelitian lainnya. Dan begitu kondisi yang optimum sudah diperoleh, maka metode tersebut dapat digunakan secara konsisten.
