Archive for the ‘PCR’ Category
SYBR Green dye (image from vulgariz.com)
Kontributor: Yul Kurniatun
Kesadaran mengenai keamanan, telah mendorong pemilihan bahan yang aman dan ramah bagi personal laboratorium dan lingkungan. Contohnya pada praktek biologi molekuler. Sekarang tersedia alternatif pengganti ethidium bromide (EtBr) yang diklaim lebih aman, yaitu SYBR green. Tersedia di pasaran dengan nama dagang SYBR green I nucleic acid gel stain dan SYBRsafe dalam konsentrasi 10.000X.
Mengutip dari Wikipedia, SYBR green I bersifat 25X lebih sensitif dibandingkan EtBr. Sementara, SYBRsafe yang merupakan turunan dari SYBR green memiliki sensitifitas sama dengan EtBr. Namun potensi yang ada akan berkurang nilainya jika penggunaan bahan tidak dilakukan secara tepat.
+Continue Reading
RT PCR alias Reverse Transcriptase PCR adalah teknik yang digunakan untuk membuat cDNA (complementary DNA) dengan RNA sebagai template-nya. Proses ini adalah kebalikan dari transkripsi DNA menjadi RNA yang umum terjadi pada makhluk hidup, sehingga dinamakan reverse transcription (transkripsi terbalik). Di alam proses ini hanya terjadi pada virus-virus tertentu ketika menyusupkan materi genetiknya yang berupa RNA ke dalam genom ‘korbannya’. (Lihat kembali mengenai ‘Central Dogma in Molecular Biology‘).
HIV, salah satu virus yang memiliki enzim Reverse Transcriptase | Image from www.vircolab.com
Catatan: Jangan keliru dengan istilah realtime PCR yang juga sering disingkat RT PCR. Yang kita bahas di sini adalah Reverse Transcriptase PCR. Untuk membedakan biasanya istilah realtime PCR diganti dengan quantitative PCR (qPCR).
Di laboratorium, RT PCR umumnya dilakukan untuk menganalisa tingkat ekspresi genetik. Karena ekspresi setiap gen berbeda-beda, maka proses RT PCR harus dilakukan secara efisien dan tidak boleh melewatkan RNA dari gen yang tergolong ‘low copy’ dan sulit.
Berikut ini adalah beberapa tips yang mungkin dapat membantu:
Pemilihan primer RT
Ada 3 pilihan primer, oligo dT, random primer atau primer spesifik gen. Banyak orang menggunakan oligo dT karena mereka bisa mendapatkan salinan cDNA lengkap dari full mRNA.
Akan tetapi, jika mRNA-nya panjang (>4 kb) atau tidak memiliki ekor poly A (mRNA prokaryota), maka pilihannya adalah random primer. Dengan random primer, ujung 5′ gen-gen yang panjang dapat ditranskripsi balik, tetapi cDNA yang diperoleh mungkin tidak full dari seluruh gen. Biasanya digunakan random primer 6-mers, tetapi 8 atau 9-mers dapat meningkatkan ukuran cDNA karena primernya akan terhibridisasi lebih jarang.
Untuk aplikasi qPCR (quantitative PCR) gen-gen eukaryota, hasil terbaik bisa diperoleh dengan menggunakan kombinasi random primer panjang dan oligo dT.
Pilihan ketiga adalah primer spesifik gen yang dapat meningkatkan sensitivitas dengan mengarahkan seluruh aktifitas enzim RT untuk mentranskripsi balik hanya RNA tertentu saja. Jika yang kita lakukan adalah one-step RT PCR, primer spesifik gen digunakan karena primer RT juga nantinya digunakan sebagai primer reverse pada reaksi PCR-nya.
Struktur Sekunder RNA
Struktur sekunder ini bisa jadi masalah dalam transkripsi balik RNA secara utuh. Ibarat menemui jalan buntu, enzim RT dapat berhenti ketika menemui struktur sekunder pada RNA-nya.
Sulit memang memprediksi apakah RNA kita akan memiliki struktur sekunder, tapi biasanya kandungan GC yang tinggi bisa kita jadikan indikator bahwa RNA akan sulit untuk memisah dan mungkin tidak akan benar-benar menjadi utas tunggal sebelum reaksi. Untuk mengatasinya, bisa dengan melakukan denaturasi dulu pada suhu 65C selama 5 menit sebelum reaksi RT agar RNA-nya dalam keadaan rileks.
Pendekatan lainnya adalah dengan menggunakan enzim RT yang dapat bekerja pada suhu yang lebih tinggi dari RT standar. Ada juga enzim RT yang mampu menembus struktur sekunder RNA meski dilakukan pada suhu RT standar.
Menyingkirkan gDNA
Kontaminasi DNA genom (gDNA) pada RNA merupakan salah satu penyebab terjadinya false positif saat reaksi PCR nantinya. Ada beberapa cara untuk menyingkirkan gDNA, misalnya pemberian DNase selama proses atau setelah isolasi RNA.
Jika sample RNA diisolasi dari sel eukaryota, maka cara terbaik menghindari kontaminasi gDNA ketika PCR adalah dengan mendesain primer yang menyeberangi intron atau batas intron-exon. Seperti kita tahu bahwa mRNA pada eukaryota merupakan hasil transkripsi dari exon pada gDNA tanpa diseling-selingi lagi oleh intron-intron. Dengan cara ini tidak akan terjadi amplifikasi terhadap gDNA (atau setidaknya akan memiliki produk PCR yang berbeda ukurannya).
Satu hal yang harus diwaspadai adalah pseudogene, yaitu salinan dari mRNA hasil splicing yang diinsersikan ke dalam genom. Primer yang didesain hanya untuk mRNA tadi tetap akan mengamplifikasi pseudogene ini.
Untuk mRNA prokaryota masalah tidak akan selesai dengan primer yang didesain menyeberangi intron karena gDNA prokaryota tidak memiliki intron, sehingga penyingkiran gDNA ini amat krusial untuk keakuratan pengukuran ekspresi gen. Satu-satunya pilihan adalah reaksi enzimatik selama proses isolasi mRNA seperti yang diuraikan di atas. Harus dipastikan pula bahwa gDNA benar-benar tidak mengganggu amplifikasi, misalnya dengan buffer-buffer tertentu penghilang sisa-sisa DNA atau dengan mengamplifikasi (PCR) langsung RNA hasil isolasi tanpa melalui proses RT PCR. Jika amplifikasi PCR tetap terjadi berarti gDNA masih bercokol di situ.
Memeriksa RNA Integrity
Kualitas RNA amat berpengaruh terhadap hasil sintesa cDNA. Variasi kualitas RNA dari batch-ke-batch dapat menyebabkan hasil yang tidak konsisten. Sebelum melakukan reaksi RT PCR, kita harus memeriksa kualitas band rRNA dengan melarikannya pada gel agarose dan memeriksanya secara visual. RNA eukaryota yang masih utuh (intact) ditunjukkan dengan adanya dua band rRNA 28s dan 18s yang jelas dengan intensitas pita 28s (lebih besar) kira-kira 2 kali intensitas pita 18s (lebih kecil). Jika intensitasnya sama pun masih bisa dianggap bagus.
Jangan gunakan RNA yang memiliki smear tebal di sekitar pita rRNA apalagi pada bagian bawah untuk reaksi RT PCR. Karena jika demikian sample RNA tersebut telah terdegradasi.
Cara yang lebih akurat dan hemat sample adalah menggunakan Agilent BioAnalyzer untuk menentukan kualitas RNA secara lebih akurat. Selain menampilkan visualisasi pita-pita RNA dalam bentuk grafik, juga dapat menghitung RNA Integrity Number (RIN) secara kuantitatif. Skor RIN sempurna adalah 10, RIN 8 tetap OK, dan jika sudah di bawah 7 maka artinya sample RNA kita sudah terdegradasi dan akan menyebabkan hasil yang tidak konsisten. Cara ini memang lebih mahal tetapi hasil yang diberikan sangat akurat, terlebih jika sample RNA akan digunakan untuk analisa ekspresi seperti microarrays.
Pengukuran Kuantitas RNA
Selain keutuhan RNA, kuantitas hasil isolasi RNA pun penting untuk diketahui. Akurasi hasil pengukuran dapat dipengaruhi beberapa faktor seperti akurasi instrumen yang digunakan, kontaminasi DNA, garam-garam, dan juga tingkat degradasi RNA. Untuk pengukuran kuantitas RNA, spektrofotometer Nanodrop adalah alat yang digemari karena kemudahan dan akurasinya, disamping itu jumlah sampel yang diperlukan hanya 1 uL saja sehingga sangat menghemat sampel RNA yang sangat berharga untuk penelitian selanjutnya.
Kelemahan instrumen spektrofotometer UV untuk pengukuran RNA adalah bahwa DNA genom dan garam-garam yang mengkontaminasi akan terukur juga absorbansinya bersama dengan RNA sehingga akan menyebabkan false positive. Untuk itu dikembangkan suatu teknik pewarnaan spesifik RNA menggunakan Ribogreen, jadi yang diukur absorbansinya adalah Ribogreen yang terikat pada RNA sehingga hasil pengukuran akan lebih akurat.
One Step RT-PCR atau Two Step RT-PCR?
Pada one step RT-PCR, reaksi transkripsi balik untuk mengkonversi RNA menjadi cDNA dan reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen tertentu yang ingin kita ketahui ekspresinya dilakukan dalam satu rangkaian reaksi dan dalam satu tabung reaksi yang sama. Sedangkan pada two step RT-PCR, reaksi transkripsi balik dan reaksi PCR dilakukan secara terpisah dan melibatkan beberapa tabung reaksi.
Masing-masing cara memiliki keunggulan dan kelemahan, dan pilihannya amat bergantung pada penelitian yang kita lakukan. Dengan one step RT-PCR, tidak ada proses transfer sample sehingga mengurangi sumber kontaminasi, dan karena digunakan primer spesifik untuk RT-PCR dan PCR, maka sensitifitasnya bisa lebih baik. Dengan two step RT-PCR, RNA dapat dikonversi menjadi cDNA dalam jumlah besar sekaligus, baru kemudian dialiquot untuk digunakan pada analisis beberapa gen berbeda. Ini dapat mengurangi variasi ketika membandingkan ekspresi beberapa gen dari sumber yang sama. Pilihan primer pun beragam, bisa oligo dT, random primer atau primer spesifik gen. Jadi, pilihannya bergantung kebutuhan riset kita.
Karena banyak faktor yang mempengaruhi kesuksesannya, maka alangkah baiknya kita merancang metode RT-PCR ini dengan lebih baik, dan kondisi yang optimum bisa saja bervariasi dari satu penelitian ke penelitian lainnya. Dan begitu kondisi yang optimum sudah diperoleh, maka metode tersebut dapat digunakan secara konsisten.
Image from www.labnews.co.uk
Anda tentu mengenal Realtime PCR, ada hal-hal penting yang harus kita fahami dan lakukan untuk mendapatkan hasil yang dapat dipercaya dan konsisten. Apalagi kita tahu bahwa setiap reaksi realtime PCR memakan biaya yang tidak sedikit.
Dibanding teknik PCR konvensional (end-point PCR), realtime PCR memiliki berbagai keunggulan. Selain amplifikasi alias perbanyakan DNA fragmen yang dapat diamati seketika (secara realtime), dengan teknik ini kita pun dapat menentukan konsentrasi DNA yang terdapat pada sample. Maka tak heran jika teknik ini sering pula disebut Quantitative PCR (qPCR).
Bagaimana bisa amplifikasi diamati secara realtime? Kuncinya ada pada pewarna (dye) fluorescent (baik SYBR Green atau oligonucleotide terlabel fluorescent) yang dicampurkan ke dalam reaksi amplifikasi. Dye fluorescent ini (misal SYBR Green) bersifat dapat berpendar ketika ditembak oleh sinar laser (energi) jika terikat pada DNA utas ganda. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA hasil amplifikasi dapat diikuti secara realtime, semakin banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan. Sementara itu quantitative PCR dimungkinkan karena sensitifitas dye yang sangat tinggi, bahkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA hingga hitungan picogram (atau setara dengan sel tunggal saja!).
Sensitifitas yang tinggi seperti ini tentu saja rentan terhadap bias, sehingga perlu diperhatikan beberapa teknik berikut ini agar data yang diperoleh bisa konsisten dari waktu ke waktu dan selalu dapat diandalkan. Masalah yang sering muncul adalah adanya kontaminan dan ketidakkonsistenan hasil diantara ulangan.
Campur dengan Baik
Pembuatan mastermix adalah tahapan krusial dalam realtime PCR, sebab campuran pereaksi-pereaksi ini (dye, nukleotida, enzim, buffer, dll) selanjutnya akan dialiquot ke masing-masing tube/plate reaksi. Jika mastermixnya tidak homogen, maka jangan harap kita akan mendapatkan hasil yang konsisten.
Pastikan mastermix (baik yang fresh maupun yang telah disimpan di dalam freezer) telah tercampur dengan baik sebelum dialiquot, gunakanlah vortex.
Larutkan primer di dalam buffer
Seringkali kita melarutkan stok primer menggunakan air (ddH2O), padahal pH air bisa saja rendah (apalagi DEPC-treated ddH2O) yang bisa merusak DNA dalam waktu lama. Maka sebaiknya gunakan larutan buffer dengan pH netral untuk mencegah hidrolisis asam. Untuk mencegah aktifitas enzim DNase, bisa juga ditambahkan EDTA (1 mM) pada stok master primer, jangan takut EDTA akan menghambat aktifitas enzim Taq polymerase ketika PCR berlangsung karena konsentrasinya akan menjadi sangat kecil setelah dicampur menjadi mastermix/premix.
Biasakan untuk mengaliquot primer
Satu aturan yang harus ditaati dalam lab bioteknologi molekuler adalah sebisa mungkin hindarilah freeze/thawing, karena bisa mengundang kontaminan dan menyebabkan rusaknya primer. Maka jika kita mempunyai stok master primer (biasanya 100 uM), encerkanlah pada konsentrasi kerjanya (10 – 20 uM) menggunakan buffer netral dan buatlah aliquot. Usahakan agar primer tidak di-freeze-thaw lebih dari 5 kali.
Selain menghindari freeze-thaw berulang-ulang, peng-aliquot-an ini juga memudahkan kita saat terjadi kontaminasi, karena jika salah satu tabung primer terkontaminasi, kita masih memiliki stok primer lain yang masih bersih.
Gunakan pipet terkalibrasi dan ekslusif
Akurasi volume penambahan pereaksi seringkali menjadi masalah terutama jika volume yang ditambahkan sangat kecil. Untuk itu gunakan pipet sesuai jangkauan volumenya, gunakan teknik pemipetan yang baik dan pastikan pipet selalu dikalibrasi secara rutin.
Perlu disadari pula bahwa penggunaan pipet yang sama untuk berbagai keperluan merupakan sumber utama kontaminasi. Jangan gunakan pipet yang dipakai untuk ekstraksi DNA atau loading elektroforesis pada proses pembuatan mastermix realtime PCR, walaupun tips yang digunakan adalah tips aerosol resistant. Belilah satu set lengkap pipet yang didedikasikan khusus untuk pembuatan campuran pereaksi PCR, jangan dipakai untuk keperluan lain.
Buat kurva standar untuk setiap pasang primer baru
Setiap kali pesanan primer baru datang, buatlah sebuah kurva standar untuk menguji efisiensi reaksinya. Jangan mengasumsikan bahwa efisiensinya sama dengan primer yang sebelumnya digunakan, karena beda produksi bisa beda pula hasilnya.
Buatlah kurva standar 5 titik dengan jarak antar titik adalah 10 kali pengenceran. Pastikan bahwa kita dapat memperoleh efisiensi minimal 90% dengan menggunakan kontrol DNA.
Sediakan ruangan terpisah
Seperti halnya pipet, ruangan pun harus dibuat ekslusif dan terpisah, idealnya 3 ruangan, ruang ekstraksi DNA/RNA, ruang pembuatan campuran pereaksi (plus laminar air flow hood dengan sinar UV), serta ruang penambahan template DNA/RNA dan mesin realtime PCR itu sendiri. Dengan adanya pemisahan ruang dengan baik diharapkan tidak terjadi reaksi amplifikasi pada kontrol negatif akibat kontaminasi.
Cek ulang program siklus PCR
Cek ulang apakah kondisi siklus PCR sudah diprogram dengan benar sebelum reaksi PCR dimulai. Ini terutama wajib dilakukan jika mesin realtime PCR tersebut digunakan secara bersama-sama, karena ada kemungkinan program siklus PCR yang sudah kita simpan diubah oleh seseorang tanpa sepengetahuan kita. Tak ada salahnya kita mengecek ulang dari pada pada akhirnya reaksi amplifikasi kita gagal total.
Encerkan template
Realtime PCR jauh lebih sensitif dibanding PCR konvensional, jadi jangan samakan penambahan template untuk realtime PCR dengan PCR konvensional. Malahan seringkali jumlah template yang sedikit/encer memberikan hasil pengukuran yang lebih akurat. Di samping itu pengenceran dapat mengurangi efek kontaminan inhibitor yang mungkin terbawa saat isolasi DNA/RNA, karena ikut terencerkan maka efeknya terhadap akurasi sampel pun dapat ditekan.
Idealnya kurva sampel melintasi garis threshold antara siklus 20-30, ini dapat dicapai dengan mengatur konsentrasi sampel. Untuk sampel-sampel baru, kita bisa membuat dulu kurva kalibrasi (minimal 3 seri pengenceran standar) untuk melihat pada pengenceran sampel berapakah yang memberikan Ct (cycle threshold) yang berada di dalam kurva sehingga hasilnya akan akurat.
Buatlah larutan pengenceran fresh
Konsentrasi larutan asam nukleat (DNA/RNA) jika disimpan pada tabung plastik makin lama akan semakin berkurang. Ini karena asam nukleat dapat menempel pada dinding tabung. Oleh karena itu gunakan selalu serial pengenceran yang baru/fresh. Jika terpaksa harus menyimpannya untuk keperluan pengukuran berikutnya, maka gunakan Pelindung seperti carrier nucleid acid seperti tRNA, atau menggunakan tabung yang telah diberi perlakuan silikon atau dengan menggunakan tabung yang tidak mengikat DNA/RNA. Jangan lupa pula untuk mengukur kembali konsentrasinya sebelum digunakan untuk memastikan bahwa konsentrasinya tidak berubah.
Tips-tips di atas sangat penting diperhatikan terutama bagi para peneliti yang baru memulai penggunaan metode realtime PCR, karena langkah-langkah kecil seperti di atas sangat menentukan kekonsistenan dan tingkat kepercayaan hasil analisa kita.
Bagi Anda yang sudah terbiasa menggunakan realtime PCR, sangat kami tunggu urun-rembugnya jika ada hal-hal lain yang perlu diperhatikan selain yang telah kami uraikan. Bagian komentar di bawah ini dapat mewadahi kita untuk berdiskusi lebih lanjut.
Sumber: BiteSizeBio
Tentu Anda sudah mengenal yang namanya DNA. DNA ini sering disebut-sebut terutama berkaitan dengan kriminalitas, diagnosa penyakit, penentuan ‘keabsahan’ keturunan, dll. Mungkin Anda bingung bagaimana caranya polisi bisa mengungkap pelaku kejahatan dengan berbekal sehelai rambut pelaku yang tercecer di TKP, atau dari tetesan sperma pemerkosa yang mengering di tubuh korban. Padahal kan sampel yang dianalisa jumlahnya sangat sedikit, ajaib!
Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction. Proses yang berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 µl ini mampu menggandakan atau mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula. Maka pantes aja dengan berbekal DNA yang terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai kebutuhan kita.
Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA polymerase.
PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Nah, sekarang bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali, dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup, 2 pangkat 30 alias 1.073.741.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu, kita masih harus memperhitungkan efisiensi reaksi, tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.
Komponen PCR
Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang dibutuhkan adalah:
Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.
dNTP (deoxynucleoside triphosphate)
dNTP alias building blocks sebagai ‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.
Buffer
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.
Ion Logam
- Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.
- Ion logam monovalen, kalsium (K+).
Tahapan Reaksi
Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:
Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.
Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.
Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.
Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:
Pra-denaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).
Final Elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir
PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah sekarang mesin Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.
Aplikasi teknik PCR
Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:
Isolasi Gen
Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu apaan ya?
Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.
Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.
Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga [http://www.littletree.com.au/dna.htm]. Dan ajaib! Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus ‘mengorbankan’ sapi atau babi.
Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama ‘probe’ yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
DNA Sequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.
Forensik
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.
Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua ‘sesungguhnya’ dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.
Diagnosa Penyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat.
PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.
Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun setelah penemuannya (1993).
Sumber: Wikipedia, Andy Vierstraete dan sumber-sumber lainnya.
quantitative/realtime pcr presentationBerikut ini adalah materi presentasi mengenai dasar-dasar Quantitative PCR atau Real Time PCR dalam format PDF. Materi ini meliputi:
- Pendahuluan Quantitative PCR
- Metoda Deteksi
- Analisa Hasil
Untuk yang berminat bisa mendownload melalui link berikut ini:
- qPCR
- PCR & qPCR movie by Scanelis
Semoga bermanfaat.
