Troubleshooting Guide. ‘Keanehan-keanehan’ pada Electropherogram

Tuesday, April 21st, 2009 | No Comments Posted by yepyhardi

dna_sequencer Hasil analisa DNA sequencing idealnya terdiri atas peak-peak yang terbaca dengan jelas, memiliki baseline noise rendah, background yang tidak signifikan dan memiliki spasi antar peak yang merata. Namun pada kenyataannya terkadang electropherogram dari sampel kita jauh dari harapan dan mengandung banyak ‘keanehan-keanehan’. Apa saja keanehan yang sering terjadi dan mengapa bisa terjadi?

Electropherogram hanya berisi noise atau peak-peak yang lemah

Tidak jarang hasil DNA sequencing tidak dapat terbaca karena peak yang muncul sangat buruk kualitasnya, boleh dibilang hanya ada noise pada electropherogram, sehingga software komputer membacanya sebagai deretan ‘N’ tak berujung. Pendek kata hasil pembacaan komputer sama sekali tidak dapat dipercaya dan analis tidak dapat melakukan interpretasi apapun. Berikut ini contoh electropherogramnya:

Berikut ini beberapa kemungkinan yang dapat menyebabkan buruknya hasil analisa DNA Sequencing.

Masalah pada DNA Template

Tidak ada DNA template dalam tabung reaksi (atau sangat tidak mencukupi).

Kalau tidak ada DNA template bagaimana reaksi cycle sequencing bisa berjalan? Untuk itu sebelumnya lakukanlah kuantitasi DNA menggunakan spectrophotometer dan perhatikan hal-hal berikut:

Pastikan pembacaan absorbansi setidaknya 0.1 AU (atau 0.05 AU jika spectrophotometernya sudah terkalibrasi dengan baik)
Spectrophotometer biasa umumnya tidak mampu mengukur konsentrasi DNA hasil isolasi mini-prep, PCR produk atau fragment hasil elusi gel, Anda harus menggunakan spectrophotometer skala mikroliter seperti GenQuant atau Nanodrops.

Anda bisa juga mengestimasi konsentrasi DNA menggunakan gel analitik untuk mengestimasi konsentrasi DNA. Namun estimasi seperti ini sulit dilakukan dan perlu keahlian khusus.

Masalah pada Primer

Bisa jadi tidak ada Primer dalam tabung reaksi atau sangat tidak mencukupi.

Periksa kembali perhitungan konsentrasi primer, seringkali kita rancu antara pikomolar, pikomol, pikomol per mikroliter dan mikromolar. Hati-hati sebab jika Anda diminta mengirimkan primer dengan konsentrasi 10 pikomol per mikroliter sedangkan Anda mengirimkan yang 10 pikomolar, maka perbedaannya 10 pangkat 6!

Mol adalah satuan jumlah, liter satuan volume dan molar merupakan satuan konsentrasi yang sama dengan mol per liter. Sedangkan mikro, nano dan piko merupakan faktor pengali sebesar berturut-turut 10^(-6), 10^(-9) dan 10^(-12). Jadi suatu larutan primer dengan konsentrasi 10 mikromolar sama saja dengan 10 pikomol per mikroliter.

Ingat-ingat lagi pelajaran SMA, dimana konsentrasi molar dirumuskan sebagai:
Molaritas = (Jumlah zat [mol] / Volume [L])
Kalau dibolak-balik, maka:
Jumlah zat [mol] = Molaritas [M] x Volume [L]

Primer tidak berinteraksi dengan template secara efisien

Berikut ini beberapa kemungkinannya:

Cek kembali identitas plasmid Anda

Plasmid bisa menyebabkan eror karena kesalahan kloning, kerusakan pada situs penempelan primer, terkontaminasi oleh plasmid lain yang tidak memiliki situs primer sehingga plasmid sebenarnya jadi terencerkan. Cara teraman adalah dengan membuat peta enzim restriksi lengkap untuk mencari band-band yang tidak diharapkan. Jangan hanya memotong insert-nya saja untuk memverifikasi plasmid konstruk.

Apakah primer didesign dari informasi sekuen yang akurat?

Dalam kasus primer walking sequencing, primer harus dirancang dari hasil sequence sebelumnya pada area dengan kualitas bagus dan valid. Merancang primer dari area yang ambigu hanya akan menyebabkan kesalahan design primer.

Apakah Anda yakin situs primer yang digunakan terdapat pada DNA template?

Misalnya jangan sampai kita mensekuen Mus castenius menggunakan primer yang dirancang untuk Mus musculus.

Mungkinkah situs primer rusak karena suatu sebab?

Kadangkala artifak-artifak kloning dapat membuat delesi dekat situs insersi, atau delesi yang merusak situs penempelan primer.

Jika templatenya berupa produk PCR, apakah ia teramplifikasi dengan benar?

Kita harus selalu menguji keakuratan produk PCR kita, bisa dengan cara menguji situs enzim restriksi yang ada di dalamnya (jika ada informasi), potong dan run pada gel. Bisa jadi dari sepasang primer, hanya satu yang menempel pada kedua ujung yang sebenarnya mengamplifikasi di daerah yang tidak diharapkan. Akibatnya hasil sekuen akan menumpuk dan tidak dapat dibaca sama sekali.

Hasil sequence tidak blank, tapi sangat jelek.

Cobalah perhatikan beberapa kemungkinan berikut ini:

Inkonsistensi hasil

Sample Anda hasilnya jelek padahal sebelumnya pernah disekuen dan hasilnya bagus.

Mungkin sample Anda memiliki band yang lemah, tapi mungkin sebelumnya Anda lebih beruntung.

Ada peak-peak pada electropherogram tetapi sangat kotor dan sulit diinterpretasikan.

Periksalah teks pada electropherogram yang berbunyi

“Signal G:23 A:28 T:17 C:30″.

Biasanya terdapat pada bagian atas jika diprint atau pada jendela ‘Info’ di file elektronik electropherogram. Kekuatan signal ini mengindikasikan kekuatan fluoresen relatif band di lajur tersebut.

Umumnya signal G bisa dijadikan patokan, yaitu jika nilainya 100-1000 maka sample tersebut dikatakan bagus, idealnya sekitar 500. Jika di bawah 100, maka band background yang seharusnya tidak nampak akan mengganggu basecalling. Apalagi jika di bawah 40 maka peak yang sebenarnya bisa tenggelam di bawah background noise sehingga terbaca sebagai blank.Tapi jika beruntung, bisa saja terbaca jika backgroundnya juga lemah. Inilah yang menyebabkan inkonsistensi keterbacaan electropherogram jika signalnya lemah.

Resolusi yang rendah sejak awal

Biasanya hal ini disebabkan oleh kontaminan dalam template DNA yang menyebabkan berkurangnya resolusi/pemisahan pada instrument elektroforesis kapiler (DNA Sequencer).

Superimposed atau peaks-on-peaks

Electropherogram memiliki spasi tak beraturan atau peak-peak yang saling menumpuk (superimposed atau peaks on peaks)

Peak-peak yang saling bertumpuk biasanya terjadi akibat dua sekuen dalam satu reaksi. Ada beberapa penyebab yang umum:

Primer sequencing menempel pada dua atau lebih situs penempelan pada template
Ada dua atau lebih template dalam satu tabung
Untuk sample PCR produk, primer yang digunakan ketika PCR tidak dihilangkan dulu dengan purifikasi
Sewaktu reaksi PCR, salah satu primer menempel di dua situs penempelan dan membentuk produk
Lebih dari satu reaksi amplifikasi terjadi ketika PCR

Bisa juga bagian awal electropherogram berkualitas baik namun setelah titik tertentu terjadi superimposed peak.

Di bawah ini adalah contoh ‘peak yang menumpuk’ yang timbul karena dua atau lebih template-template yang tidak saling terkait.

Sedangkan gambar berikut mungkin berasal dari template-template yang saling terkait, coba perhatikan kesejajaran (alignment) dari peak-peaknya.

Sekuennya bagus di beberapa tempat, tapi di tempat lainnya jelek

Berikut ini beberapa contoh yang mungkin terjadi:

Efek “ski-slope”

Electropherogram dimulai dengan peak-peak yang bagus tapi tingginya berkurang terus.

Dengan melihat keseluruhan gambar electropherogram dalam satu panel akan terlihat jelas efek “ski-slope” ini, ketinggian peak makin lama semakin berkurang.

Penyebab fenomena ini belum begitu diketahui, tetapi ada empat kemungkinan:

Adanya molekul-molekul garam dalam DNA, ini diduga sebagai penyebab utama
DNA template yang ditambahkan terlalu banyak
Pengotor (impurity) pada Taq polymerase
Kontaminan yang tidak diketahui meningkatkan daya ikat dye pada situs aktif enzim. Efek terakhir ini bisa muncul dari NTP bebas dalam sample, dan mungkin dari suatu kontaminan yang mengganggu konsentrasi kation divalent (EDTA, Mg++, dll).

Dye Blob

Secara umum electropherogramnya baik, tetapi di satu atau beberapa tempat muncul peak hijau (atau merah atau hitam)yang sangat besar yang mengaburkan semua peak di bawahnya.

Peak yang abnormal seperti ini dinamakan ‘dye blob’. Jika Anda cukup beruntung, peak-peak sesungguhnya yang ada di bawah peak abnormal ini masih dapat terbaca.

Ini merupakan artifak yang umum pada automated sequencing yang timbul dari kompleks yang terbentuk antara dye sequencing dan komponen lain yang tidak diketahui (atau kontaminan). Ada dua hal yang menyebabkan artifak ini:

Pemurnian samplenya tidak sempurna, sehingga ada sisa-sisa dye yang tidak terinkorporasi dalam sampel.
Sampelnya sendiri mungkin memiliki kontaminan yang mengikat dye yang tidak terinkorporasi.

Efek Struktur Sekunder

Sekuennya berjalan normal, namun tiba-tiba band-nya menjadi jauh lebih kecil.

Masalah seperti ini nampaknya disebabkan oleh struktur sekunder pada template. Agaknya DNA polymerase tidak mampu memproses beberapa bentuk ‘stem-loop’. Solusi yang mungkin dilakukan:

Mencoba mensekuen kembali dengan memilih jenis DNA sebagai ‘siRNA construct’
Mencoba mensekuen kembali dengan menggunakan primer lain pada posisi yang berbeda
Mensekuen dari arah sebaliknya
Mengulang kembali sekuen dengan kondisi cycle atau reagen khusus yang dapat ‘memaksa’ polymerase melewati daerah loop ini.

Peak lenyap tiba-tiba

Sekuennya berjalan normal, namun tiba-tiba band-nya lenyap.

Hal ini biasa terjadi ketika template DNA berakhir, misalnya pada ujung suatu PCR produk, atau jika secara tidak sengaja terpotong oleh enzim restriksi. Bisa juga disebabkan oleh struktur sekunder yang ekstrem stabil.

Peak-peak yang hilang

Beberapa peak terlihat hilang sehingga terbaca sebagai ‘N’ oleh software.

Cobalah cek, jika peak sebelum peak yang hilang berwarna hijau, ini normal. Enzim yang digunakan agak kesulitan menambahkan ‘G’ setelah ‘A’, sehingga peak ‘G’ akan lebih kecil. Periksa juga apakah di bawah ‘N’ terdapat peak kecil berwarna hitam dan peak sebelumnya adalah ‘A’. Jika iya maka peristiwa ini dinamakan ‘G’-after-‘A’ dropout. Tetapi hal ini biasanya tidak terjadi lagi dengan menggunakan enzim versi terbaru.

Penurunan Resolusi

Electropherogram pada awalnya normal, tetapi bandnya menjadi melebar setelah beberapa ratus nukleotida saja.

Biasanya resolusi (pemisahan) oleh polimer pada kapiler akan menurun setelah 750-850 nukleotida (bergantung pada jenis kapiler dan polimer yang digunakan), ini adalah hal yang normal. Jika beruntung kita bisa mendapatkan pembacaan yang bagus hingga 900 nukleotida, tapi ini jarang dan templatenya harus benar-benar bersih.

Namun jika ini terjadi pada pembacaan awal (100 – 500 nukleotida) maka ini bisa disebabkan oleh kontaminan pada template yang menyebabkan hilangnya resolusi dalam instrument elektroforesis kapiler. Berikut ini beberapa contoh ‘loss of resolution’ yang bisa terjadi.


Bagian awal, electropherogram masih OK	Agak pertangahan, mulai jelek	Bagian akhir, sulit diinterpretasikan

Efek Primer Dimer

Peak pada 10-20 nukleotida pertama tersamarkan oleh peak ‘sampah’ yang sangat besar, tapi setelah itu peak-peaknya kembali normal.

Penjelasan yang paling umum untuk masalah ini adalah terbentuknya self-dimer dari primer yang digunakan dan peak ‘sampah’ itu berasal dari dimer tersebut. Untuk mengatasinya maka primer yang digunakan harus dirancang bebas dari ‘self-dimer’. Selain itu bisa juga berasal dari ‘primer-dimer’ yang terjadi saat melakukan reaksi PCR (jika sampelnya PCR produk), untuk mengatasinya primer dimer bisa dienyahkan dengan purifikasi gel.

Peak-on Peak

Peak pada 20-50 nukleotida pertama baik-baik saja, tetapi tiba-tiba terlihat campuran peak-peak atau background yang sangat mengganggu pada electropherogram.

Ini biasa terjadi pada template DNA yang sebenarnya merupakan campuran dua atau lebih klon yang idektik hingga situs kloning dan setelah itu berbeda. Untuk mengatasinya, maka host yang mengandung klon harus di-streak hingga menjadi koloni tunggal.

Atau bisa juga akibat adanya dua situs independen dalam konstruk, dan menghasilkan sekuen yang identik pada kedua situs tersebut hingga titik dimana kedua sekuen terpisah, sehingga timbullah efek ‘peak-on-peak’. Hal ini biasa terjadi ketika Anda menggunakan primer yang ada di dalam insert sementara sebelumnya secara tidak sengaja Anda memasukkan dua kopi insert. Efek ini dapat pula disebabkan oleh error struktural lainnya.

Polymerase Slip

Sekuen di bawah ini terlihat bagus hingga mencapai area polyA (atau polyT), dan kemudian band-nya menjadi bergelombang.

Efek ini dinamakan ‘polymerase slip’. Ini terjadi ketika untai yang sedang tumbuh terpisah sementara dari template dan kemudian menempel kembali pada titik yang berbeda, misalnya satu nukleotida lebih maju atau lebih mundur dari seharusnya. Jika hal ini terjadi cukup sering maka setiap band akan membentuk peak-peak yang saling menumpuk memberikan efek seperti ‘roller coaster’ pada electropherogram. Cobalah untuk mensekuen dari arah yang berlawanan atau coba kembali menggunakan primer lain baik yang lebih dekat atau lebih jauh dari area ‘homopolymer‘.

Tentang Penulis

Belum ada informasi mengenai penulis