Troubleshooting pada SDS-PAGE (Bagian 1)

Sebelumnya telah diberikan beberapa tips dan trik yang dapat mempermudah pengerjaan SDS-PAGE namun tentunya masalah bisa datang tanpa ada yang tahu. Apakah hasil yang buruk, proses SDS-PAGE yang terganggu, atau kerusakan di gel, banyak sekali hal yang dapat memperlambat dan mengganggu proses pengumpulan data kita. Dalam artikel kali ini akan dibahas troubleshooting untuk beberapa masalah yang umum ditemukan pada proses SDS-PAGE. Semoga dapat membantu!

Resolusi pita yang buruk

• Jumlah sampel yang dimuat terlalu banyak. Pekatkan sampel
• Pembentukan micelle pada sampel yang berlebih. Perbandingan yang ideal adalah tidak melebihi 200 mikrogram SDS untuk 30 mikroliter sampel

Proses running terlalu lama

• Buffer running terlalu pekat. Encerkan buffer bila perlu
• Naikkan voltase sekitar 25-50%

Proses running terlalu cepat

• Buffer running terlalu encer. Pekatkan buffer bila perlu
• Turunkan voltase sekitar 25-50%

Muncul pita yang tak diinginkan pada sampel yang sudah murni

• Hal ini disebabkan aktivitas proteolisis. Kurangi jeda waktu antara persiapan sampel dengan mulai running

Pita yang muncul terlalu sedikit dari yang diharapkan dengan adanya penebalan pita pada bagian bawah

• Konsentrasi akrilamida di gel terlalu rendah. Naikkan konsentrasi gel sesuai kebutuhan

Pita yang harusnya muncul tunggal terlihat ganda (doublet)

• Terjadi re-oksidasi pada sampel atau sampel tidak tereduksi sempurna. Gunakan agen pereduksi (beta-merkaptoetanol atau DDT) yang masih baru atau naikkan konsentrasi agen pereduksi

Pita yang bengkok atau terdistorsi

• Polimerisasi yang buruk pada bagian sumur. Naikkan konsentrasi ammonium persulfat (APS) dan TEMED sebanyak 25%
• Konsentrasi garam pada sampel terlalu tinggi. Lakukan dialisis, sentrifugasi dengan Amicon, atau penyaringan dengan kolom
• Tekanan pada gel terlalu tinggi di dalam chamber. Perhatikan jangan sampai menjepit gel dalam plate terlalu kencang dalam chamber
• Permukaan gel tidak rata. Periksa apakah perangkat pembuatan gel berada di bidang rata. Yakinkan gel pemisah telah rata pada saat perataan dengan air atau etanol
• Gel memanas tidak merata. Gunakan sistem pendingin pada chamber atau turunkan tegangan
• Materi tidak larut pada gel atau ukuran pori yang tidak konsisten. Saring semua reagen sebelum penggunaan dan pastikan master mix tercampur dengan baik atau lakukan degassing bila perlu

Pita menyebar ke kiri dan kanan (spreading)

• Difusi sampel keluar dari gel sebelum running dimulai. Kurangi jeda antara memuat sampel dengan mulai running
• Difusi saat pergerakan melewati gel pemisah. Naikkan voltase sekitar 25% atau naikkan konsentrasi gel pemisah 1%

Pita menyebar ke atas (streaking)

• Sampel mengendap. Sentrifugasi sampel sebelum memuat ke sumur atau apabila hal ini terus terjadi, kurangi konsentrasi gel pemisah
• Konsentrasi sampel terlalu tinggi. Encerkan sampel atau kurangi voltase sekitar 25%

Pita membengkok ke atas pada sisi-sisi gel (smiling)

• Bagian tengah gel lebih panas dari sisinya. Kurangi daya. Yakinkan komposisi running buffer telah tepat

Protein yang sama muncul di sumur sebelahnya

• Sampel mengkontaminasi sumur lainnya. Gunakan tip khusus dan jangan memasukkan sampel terlalu banyak
• Jangan menunggu terlalu lama saat memuat sampel. Sumur yang penuh lambat laun dapat mengkontaminasi sumur sebelahnya yang kosong

Pergerakan yang tidak konsisten dari satu running dengan yang lainnya

• Katalisis yang tidak sempurna. TEMED dan APS yang terlalu tinggi. Konsentrasi APS dan TEMED seharusnya sekitar 0.05%
• Kualitas reagen yang berbeda dari batch yang satu dengan yang lainnya atau reagen yang terlalu tua. Gunakan satu batch reagen selama mungkin. Ganti reagen yang terlalu tua
• Jumlah protein yang dimuat tidak seragam. Jangan memuat terlalu banyak. Pastikan jumlah yang dimuat selalu sama

Sampel membentuk agregat

• Beberapa protein tidak tahan suhu tinggi. Lakukan pemanasan pada suhu 60^oC
• Pembentukan ikatan disulfida antar protein karena kurangnya agen pereduksi. Siapkan buffer sampel yang baru

Bentuk pita tidak jelas (streaking)

• Konsentrasi garam terlalu tinggi. Endapkan protein dan larutkan dalam buffer dengan kadar garam lebih rendah
• Sampel terlalu kental atau kurang SDS. Encerkan sampel dalam larutan SDS

Penumpukan pita di bagian atas gel

• Konsentrasi gel terlalu tinggi. Turunkan konsentrasi
• Terbentuk agregat protein

Ukuran protein secara tidak wajar meningkat

• Protein dengan konsentrasi karbohidrat >10% sulit terikat dengan SDS. Periksa konsentrasi karbohidrat dan bersihkan
• Protein hidrofil sulit berikatan dengan SDS
• Potassium atau kation divalen pada sampel dapat mengendapkan SDS. Endapkan sampel dan resuspensi pada buffer yang berbeda

Ukuran protein secara tidak wajar menurun

• Protein hidrofobik mengikat lebih banyak SDS
• Pemutusan ikatan disulfida yang tidak cukup karena kurangnya agen pereduksi. Siapkan buffer sampel dan sampel yang baru

Bersambung ke bagian ke-2. Sabar ya..

Other articles you may like:

• Troubleshooting pada SDS-PAGE (Bagian 2)
• Troubleshooting pada SDS-PAGE (Bagian 3 – Habis)
• Tips & Trik untuk SDS PAGE
• Pewarnaan Gel dengan SYBR Green
• Trik Mengatasi Kebocoran Gel SDS-PAGE
• Berbagai Larutan Buffer
• Menambahkan Ekor “A” pada Produk PCR Blunt

Tags: buffer electrophoresis elektroforesis poliakrilamida polyacrylamide protein sds page sdspage troubleshooting