Troubleshooting pada SDS-PAGE (Bagian 3 – Habis)

Sampai saat ini kita telah melihat masalah yang timbul selama proses persiapan dan running SDS-PAGE. Kali ini kita akan melihat dan membagikan solusi atas masalah yang biasa muncul saat proses sesudah running terutama saat proses pewarnaan hasil elektroforesis.

Pewarnaan yang tidak spesifik dengan Coomassie

• Dekomposisi zat pewarna yang tidak larut. Lakukan filtrasi larutan pewarna

 Pita protein tidak terlihat dengan baik

• Pewarnaan dengan Coomassie tidak cukup sensitive. Gel dapat dicuci dan dilakukan pewarnaan dengan silver staining
• Protein yang dimuat di gel jumlahnya kurang. Untuk pewarnaan gel dengan Coomassie biru, jumlah protein yang diperlukan minimal adalah 0.5 mikrogram untuk mendapatkan hasil yang baik
• Volume Coomassie biru yang digunakan kurang. Tingkatkan jumlah volume Coomassie biru untuk membantu melarutkan SDS yang masih tersisa di gel
• Gunakan larutan pewarna yang lebih pekat dan waktu pewarnaan yang lebih lama
• Periksa konsentrasi methanol pada larutan pewarna. Methanol berperan untuk melunturkan SDS pada gel. Naikkan jumlah methanol dalam larutan apabila diperlukan

 Pewarnaan gel yang tidak merata

• Penetrasi zat pewarna ke dalam gel yang tidak sempurna. Tambahkan waktu pewarnaan
• Zat pewarna yang tidak cukup
• Agitasi yang tidak cukup saat pewarnaan
• Konsentrasi SDS yang terlalu tinggi dapat mengganggu pewarnaan Coomassie

 Gel mengkilap seperti logam setelah pewarnaan Coomassie

• Pelarut telah menguap sehingga zat pewarna pada gel telah mengering

 Permukaan gel tertutup lapisan tipis Coomassie setelah pelunturan

• Lapisan pewarna pada gel dapat dibersihkan dengan melakukan pembilasan cepat dalam methanol 50% atau mengelap permukaan gel dengan halus dan perlahan menggunakan kertas tissue yang direndam di dalam larutan peluntur

 Noda pada pinggir atau permukaan gel

• Dapat disebabkan karena penanganan yang tidak menggunakan sarung tangan

 Muncul daerah yang diwarnai dari atas gel sampai ke bagian pergerakan buffer sampel paling bawah

• Kontaminasi buffer sampel. Gunakan buffer sampel yang baru

 Latar belakang yang pekat pada silver staining

• Kontaminasi asam akrilat pada larutan asam akrilamida dan/atau bis-akrilamida. Gunakan reagen dengan kualitas yang lebih baik
• Latar belakang yang muncul pada pewarnaan pita protein menggunakan silver staining biasa disebabkan oleh gugus amida pada ikatan seberang silang dari bis-akrilamida. Apabila latar belakang sangat mengganggu pembacaan, gunakan diakrilipiperazina sebagai pembentuk ikatan seberang silang pada gel. Ikatan seberang seberang silang menggunakan senyawa ini dapat meningkatkan pemisahan secara elektroforesis dan mengurangi latar belakang

 Pita yang telah diwarnai menjadi pudar

• Pelunturan yang terlalu lama. Warnai gel kembali dan persingkat waktu pelunturan

 Gel retak saat pengeringan dengan vakum

• Vakum dihentikan sebelum gel benar-benar kering
• Ketebalan gel di atas 1.5 mm
• Gel mengembang sebelum dikeringkan

Other articles you may like:

• Pewarnaan Gel dengan SYBR Green
• Analisa Protein dengan Metode Bradford
• Troubleshooting pada SDS-PAGE (Bagian 2)
• Troubleshooting pada SDS-PAGE (Bagian 1)
• 9 Tips untuk Real-Time PCR
• Kelebihan dan Kekurangan Darah Tali Pusat
• TE Buffer vs ddH2O

Tags: buffer coomassie electrophoresis elektroforesis poliakrilamida polyacrylamide protein sds page sdspage troubleshooting